TRIP-1抗體的制作及應(yīng)用

張宏玲 萬駿 董一辰 曹威 張新勝 張錦勰 黃來強(qiáng)

（1. 清華大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，北京 100084；2. 清華大學(xué)深圳研究生院生命與健康學(xué)部生物醫(yī)藥研究中心和基因與抗體治療重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，深圳 518055）

TRIP-1（transforming growth factor-β receptor interacting protein）最初是在B細(xì)胞文庫中使用酵母雙雜交的方法，利用TGFβRⅡC端作為誘餌蛋白，發(fā)現(xiàn)的一個含有5個WD40重復(fù)結(jié)構(gòu)域的蛋白，分子量為36 kD［1］。TRIP-1可以被TGFβ二型受體磷酸化。TRIP-1是TGFβ信號通路的調(diào)節(jié)子，可以抑制TGF-β所調(diào)控的血漿纖維蛋白溶酶原激活抑制因子-1（PAI-1）基因轉(zhuǎn)錄［2］，細(xì)胞遷移，表皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）［3］和骨細(xì)胞的分化中起重要的調(diào)控作用［4，5］。TRIP-1也是一個與癌癥密切相關(guān)的蛋白，被發(fā)現(xiàn)在多種癌癥中高表達(dá)。另外，TRIP-1可作為eIF3i蛋白存在細(xì)胞內(nèi)行使蛋白質(zhì)翻譯功能［6，7］。目前，TRIP-1的功能仍然還不很清楚。

抗體是研究蛋白功能至關(guān)重要的工具。TRIP-1蛋白被克隆17年以來，相關(guān)的研究文獻(xiàn)并不多見，直到近兩年才出現(xiàn)TRIP-1商業(yè)化抗體，但商業(yè)化抗體用量有限且價格昂貴。為了便于后續(xù)研究，本實(shí)驗(yàn)室通過動物免疫來生產(chǎn)大量TRIP-1特異抗體。首先，通過RT-PCR獲得TRIP-1基因，并將其克隆到原核表達(dá)載體pET-His中，IPTG誘導(dǎo)表達(dá)TRIP-1蛋白。將誘導(dǎo)所得蛋白純化后對試驗(yàn)動物進(jìn)行免疫，一段時間后獲取抗血清，經(jīng)效價測定及純化，制造的抗體用于Western blot和免疫熒光等試驗(yàn)，旨在為進(jìn)一步研究該蛋白在真核細(xì)胞內(nèi)的功能奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

質(zhì)粒pET-His-TRIP-1，重組大腸桿菌E. coliBL21（DE3）（攜帶質(zhì)粒 pET-His-TRIP-1）為本實(shí)驗(yàn) 室 構(gòu) 建 和 保 存 ；HeLa、HepG2、HEK293、CNE、NIH3T3細(xì)胞為本實(shí)驗(yàn)室儲存；用于飼養(yǎng)哺乳動物細(xì)胞的DMEM培養(yǎng)基購自Gibico公司；新西蘭大耳兔、昆明鼠購自廣州實(shí)驗(yàn)動物中心；蛋白質(zhì)marker購自Fermentas公司；HRP酶標(biāo)二抗（抗鼠和抗兔）和FITC標(biāo)記的二抗購自KPL公司，鬼筆環(huán)肽購自Sigma公司。

1.2 方法

1.2.1 TRIP-1蛋白原核誘導(dǎo)表達(dá)及純化 隨機(jī)挑取單克隆接種于5 mL含適量抗生素LB液體培養(yǎng)基中，于37℃、200 r/min條件下過夜培養(yǎng)。然后按2%接種量接種于200 mL含抗生素新鮮的LB液體培養(yǎng)基中，于37℃、200 r/min條件下繼續(xù)培養(yǎng)。菌液濃度達(dá)OD600=0.6時加入終濃度0.2 mmol/L IPTG，37℃、200 r/min條件下培養(yǎng)。IPTG誘導(dǎo)5 h，5 000 r/min離心5 min，收集菌體，用40 mL 20 mmol/L Tris-HCl（pH8.0）緩沖液混合重懸，冰上進(jìn)行超聲處理。5 000 r/min離心，根據(jù)蛋白表達(dá)情況分別收集上清，沉淀。

1.2.2 包涵體的洗滌和純化 由于TRIP-1蛋白在包涵體中，本研究采用尿素法純化包涵體［8］，具體純化方法如下：Ni-NTA His Binding·Resin 2 mL柱預(yù)處理：用5 mL去離子水洗滌；加0.5-1 mL NiSO4；再用5 mL去離子水洗滌。用10 mL 20 mmol/L Tris-HCl（pH8.0）+8 mol/L尿素平衡柱。上樣準(zhǔn)備好的包涵體溶液［20 mmol/L Tris-HCl（pH8.0）+6 mol/L尿素溶解］，收集流出液。用10 mL 20 mmol/L Tris-HCl，100 mmol/L 咪唑，1 mmol/L β-巰基乙醇（pH8.0）+8 mol/L尿素洗滌，收集流出液。用30 mL 20 mmol/L Tris-HCl，100 mmol/L咪唑，1 mmol/L β-巰基乙醇，pH8.0洗滌，收集流出液。用10 mL 20 mmol/L Tris-HCl，300 mmol/L imidazole，1 mmol/L β-巰基乙醇，pH8.0洗脫蛋白，收集1 mL/管，蛋白在此步收集。最后用10 mL 20 mmol/L Tris-HCl，5 mmol/L咪唑，1 mmol/L β-巰基乙醇，pH8.0洗滌，收集流出液。用10 mL去離子水洗滌柱子，充滿20%乙醇，放在4℃冰箱保存。純化的蛋白用SDSPAGE電泳檢測。

1.2.3 TRIP-1兔抗血清制備 取2 mL TRIP-1蛋白（1.6 mg/mL）制品與等體積的弗氏完全佐劑（Freunds Adjuvant，complete）混合，在新西蘭大耳兔背部選取4-6個點(diǎn)進(jìn)行皮下多點(diǎn)接種，共接種4次，每次間隔14 d，第4次加強(qiáng)免疫后7 d耳緣靜脈采血，分離血清，進(jìn)行效價檢測，獲陽性結(jié)果后進(jìn)行心臟取血，將血液收集到無菌的試管中，室溫靜置1-2 h，待血液凝固后轉(zhuǎn)移到4℃冰箱中，放置過夜，至血清析出，將血清轉(zhuǎn)移到無菌的離心管中，10 000 r/min、4℃離心30 min，取上清，保存于-70℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 TRIP-1鼠抗血清制備 5只3-4周齡昆明小鼠，將200 μg抗原蛋白溶于250 μL生理鹽水并與等體積弗氏完全佐劑充分乳化，對小鼠進(jìn)行皮下注射。首次免疫2周后進(jìn)行第2次免疫，免疫原劑量減半，并用弗氏不完全佐劑乳化。第2次免疫后每隔7 d按照第2次免疫的方法繼續(xù)免疫，第4次免疫之后第3天，尾部取血分離血清，進(jìn)行效價檢測，獲陽性結(jié)果后，進(jìn)行心臟取血，將血液收集到無菌的試管中，室溫靜置1-2 h，待血液凝固后，轉(zhuǎn)移到4℃冰箱中，放置過夜，至血清析出，將血清轉(zhuǎn)移到無菌的離心管中，10 000 r/min、4℃離心30 min，取上清，保存于-70℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.5 ELISA檢測抗血清效價 抗原包被：將抗原用包被液1∶4 000稀釋（10 μg/mL終濃度），100 μL/孔加入聚苯乙烯96孔反應(yīng)板中，4℃放置過夜。洗滌：次日傾去凹孔內(nèi)的液體，PBST洗3次。封閉：加100 μL/孔3% BSA，室溫放置0.5 h。洗滌：用PBST洗3次。

加待測樣品（一抗）：將抗體血清在另一塊板上用PBS連續(xù)稀釋，100 μL/孔加到已包被的板上，每個樣品平行做兩份，免疫前的血清作為陰性對照。加蓋37℃恒溫箱溫育1 h。洗滌：用PBST洗3次。

加HRP酶標(biāo)二抗：用封閉液1∶8 000稀釋，100 μL/孔，加蓋37℃恒溫箱溫育1 h。 洗滌：用PBST洗5次，蒸餾水洗2次。顯色：加新鮮配制的底物溶液100 μL/孔暗處放置5-30 min，顯示藍(lán)色。終止反應(yīng)，比色：加50 μL/孔終止液，顏色變黃；用酶標(biāo)儀測定450 nm處各孔的吸光值，陽性反應(yīng)的最大稀釋度為待測樣品的效價。

1.2.6 ELISA檢測抗體相對親和力 方法同1.2.5。用抗原包被酶標(biāo)板，使用兩個濃度梯度即0.5 μg/mL和1.0 μg/mL抗原包被，4℃放置過夜；以多抗?jié)舛鹊膶?shù)為橫坐標(biāo)，A450值為縱坐標(biāo)作圖。以曲線達(dá)到水平的A450值為100%，求出A50，即50%的A450值時對應(yīng)的抗體摩爾濃度。按照文獻(xiàn)［9，10］的方法進(jìn)行計(jì)算。

1.2.7 Western blot 檢測 將收集的細(xì)胞加入SDS加樣緩沖液，煮沸10 min，離心后取上清液進(jìn)行SDSPAGE后電轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，以5%的脫脂牛奶封閉2 h，與自制兔抗人、鼠抗人TRIP-1的多克隆抗體4℃過夜，之后用TBST每10 min洗1次，共3次；加入相應(yīng)二抗室溫1 h后用TBST洗膜3次，每次10 min，曝光。

1.2.8 細(xì)胞免疫熒光 固定在蓋玻片上的細(xì)胞用PBS漂洗3次，每次5 min；用3.7%的甲醛固定細(xì)胞，37℃ 10 min；0.1% TritonX-100透化10 min；PBS漂洗3次，每次5 min；5%山羊血清（PBS配制）室溫封閉1 h；去除山羊血清封閉液之后，直接加入5%BSA稀釋的一抗，4℃雜交過夜。PBS漂洗5次，每次5 min；加入5% BSA稀釋的二抗，室溫避光雜交1 h；PBS漂洗5次，每次5 min；抗催滅封片劑封片，激光共聚焦熒光顯微鏡上觀察。

1.2.9 ProteinG親和層析柱純化抗體 配制緩沖液：起始緩沖液為TBS緩沖液洗脫緩沖液為pH2.7 0.1 mmol/L甘氨酸鹽酸；準(zhǔn)備收集管：取1.5 mL離心管，每支離心管加70 μL pH9.0 1 mol/L Tris-HCl；樣品準(zhǔn)備：抗血清經(jīng)TBS進(jìn)行透析過夜，并經(jīng)0.22 μm微孔濾膜濾過。

透析過的待純化的樣品15-25 mL上柱，流速為0.5 mL/min，將留出的樣品反復(fù)過柱；然后以同樣的流速用10-20倍體積的TBS緩沖液洗滌，去除未結(jié)合和非特異性結(jié)合的蛋白，可通過測定OD280的吸光度判定洗滌是否完全；洗脫緩沖液（pH2.7，0.1 mmol/L甘氨酸鹽酸）6-7 mL每管1 mL收集洗脫液，測每管OD280吸收值。收集第2洗脫峰，BCA法測蛋白含量，4℃保存?zhèn)溆?；純化的抗體用SDS-PAGE電泳鑒定其純度用12%分離膠、5%濃縮膠，恒流下電泳2 h，考馬斯亮藍(lán)R250（Pharmacia）染色。

2 結(jié)果

2.1 TRIP-1蛋白的表達(dá)與純化

利用構(gòu)建好的pET-His-TRIP-1載體分別轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21（DE3），成功地原核誘導(dǎo)表達(dá)TRIP-1全長蛋白，并且用純化好的蛋白進(jìn)行下一步試驗(yàn)，即免疫小鼠和新西蘭大耳兔（圖1）。

圖1 TRIP-1蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)及純化結(jié)果

2.2 TRIP-1抗血清效價檢測

將用TRIP-1蛋白抗原免疫4次之后的新西蘭大耳兔以及小鼠抽取血清樣本通過ELISA法測量抗體效價，計(jì)算陽性血清和陰性血清A450值之比（antiserum/preimmune serum，a/p），當(dāng)a/p≥2.1時為陽性，當(dāng)a/p<2.1而a/p≥1.5時為可疑，當(dāng)a/p<1.5時為陰性。如圖2所示，兩種抗血清稀釋倍數(shù)為106時，和陰性血清相比，仍呈現(xiàn)陽性反應(yīng)，表明免疫后的兩種抗血清的效價均達(dá)到106。

2.3 抗體親和力檢測

通過對純化的兔抗人TRIP-1多克隆抗體進(jìn)行相對親和力檢測測定，并且計(jì)算抗體親和常數(shù)大約是105-106，可以進(jìn)行相關(guān)免疫學(xué)試驗(yàn)（圖3）。

2.4 利用抗體檢測真核細(xì)胞及組織蛋白表達(dá)情況

圖2 經(jīng)免疫過的兔（A）和小鼠（B）的血清通過ELISA法測定效價

圖3 TRIP-1兔抗相對親和常數(shù)計(jì)算圖表

利用抗體檢測真核細(xì)胞及組織蛋白表達(dá)情況，各細(xì)胞及組織蛋白，12%蛋白膠PAGE電泳，將制作好的TRIP-1鼠源及兔源抗體用于Western blot試驗(yàn)，檢測多種細(xì)胞和組織當(dāng)中的TRIP-1表達(dá)情況。將所制備抗體5 000倍稀釋用來檢測真核細(xì)胞內(nèi)源性TRIP-1蛋白表達(dá)情況，如圖4所示，兔抗和鼠抗均能夠很好地檢測真核細(xì)胞內(nèi)源性的蛋白表達(dá)，并且也能夠直接檢測從動物不同組織中抽提出來的蛋白。說明制備的抗體具有較高的靈敏度和特異性。

圖4 Western blot檢測TRIP-1鼠源（A）及兔源（B）抗體

2.5 細(xì)胞免疫熒光法檢測TRIP-1蛋白細(xì)胞內(nèi)定位

TRIP-1蛋白細(xì)胞免疫熒光檢測，取HeLa細(xì)胞進(jìn)行免疫熒光，用Phallodin-FITC染微絲（actin），同時用TRIP-1兔抗來檢測其在細(xì)胞內(nèi)的定位情況，二抗用rhodamine標(biāo)記的羊抗兔抗體。熒光顯微鏡下拍照（圖5）。將制備的TRIP-1兔抗人多克隆抗體200倍稀釋進(jìn)行細(xì)胞免疫熒光化學(xué)染色試驗(yàn)分析，發(fā)現(xiàn)制備的抗體能夠進(jìn)行細(xì)胞免疫熒光化學(xué)染色，且染色效果十分良好，同時發(fā)現(xiàn)，TRIP-1蛋白在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)位置定位明顯。

圖5 TRIP-1蛋白細(xì)胞免疫熒光檢測

2.6 TRIP-1抗體純化

取免疫過的兔和鼠的抗血清，利用proteinG方法進(jìn)行純化，成功將2種抗體進(jìn)行了初步純化，從純化結(jié)果（圖6）中可以清楚地看到抗體重鏈（55 kD）和輕鏈（26 kD）。

3 討論

圖6 抗體純化結(jié)果圖

生命科學(xué)的研究，尤其是針對某個蛋白的功能研究，抗體是至關(guān)重要的工具?？贵w可分為多克隆抗體，單克隆抗體等。單克隆抗體的特異性較好，但制作過程比較繁瑣，多克隆抗體則制作較為容易。本研究通過原核誘導(dǎo)表達(dá)發(fā)現(xiàn)誘導(dǎo)的TRIP-1蛋白主要表達(dá)在包涵體當(dāng)中，有文獻(xiàn)報(bào)道用含尿素的緩沖液洗滌包涵體，可初步純化目的蛋白，可以滿足后續(xù)試驗(yàn)中對抗原的要求［11］。鑒于此，本試驗(yàn)選擇用尿素法提取并洗滌純化包涵體得到較為純凈的TRIP-1蛋白。采用直接免疫新西蘭白兔和昆明鼠的方法獲得抗血清。ELISA是檢測抗體質(zhì)量相關(guān)系數(shù)的重要手段［12，13］。本試驗(yàn)ELISA檢測結(jié)果顯示抗血清效價極高，并且計(jì)算出的親和常數(shù)證明抗體可用于免疫學(xué)試驗(yàn)。未經(jīng)純化的抗血清，稀釋很高的倍數(shù)仍可用于Western blot和免疫熒光等試驗(yàn)，且有非常好的特異性。細(xì)胞免疫熒光法檢測TRIP-1蛋白細(xì)胞內(nèi)定位發(fā)現(xiàn)，TRIP-1蛋白在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)位置定位明顯，此結(jié)果與發(fā)表的相關(guān)文獻(xiàn)吻合［6］。同時，本研究通過proteinG的方法對多克隆抗體初步進(jìn)行了純化。以上結(jié)果表明，成功制備、純化了特異性的TRIP-1多克隆抗體，為今后深入研究TRIP-1的生物學(xué)活性和與疾病的關(guān)系及可能的臨床應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。

4 結(jié)論

本研究通過原核誘導(dǎo)表達(dá)和包涵體純化，獲得了較為純凈的TRIP-1全長蛋白。通過免疫新西蘭大耳兔和昆明小鼠，獲得了抗血清。通過ELISA、Western blot和免疫熒光試驗(yàn)驗(yàn)證了抗體的效價和特異性。結(jié)果證明用這種方法可以制備具有較高特異性和靈敏度的多克隆抗體。

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