馬鈴薯卷葉病毒P0蛋白抑制RNA沉默及其與AGO蛋白的相互作用

霍曉輝 申永梅 劉國(guó)富 曹雪松

（聊城大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，聊城 252059）

RNA沉默是一種由同源序列引起的特異RNA降解過(guò)程。RNA干擾（RNA interference，RNAi）是近來(lái)發(fā)現(xiàn)的一種重要的基因沉默現(xiàn)象，通常由雙鏈RNA介導(dǎo)。1990年Napoli首次提出植物中的RNA沉默也稱(chēng)為轉(zhuǎn)錄后基因沉默（post-transcriptional gene silencing，PTGS）［1］。高等植物對(duì)于病毒侵染有保護(hù)自身的防御機(jī)制，當(dāng)病毒侵染植物時(shí)，由病毒RNA和mRNA介導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因會(huì)引起植物對(duì)病毒的抗性，稱(chēng)為病毒介導(dǎo)的基因沉默（virus induced gene silencing，VIGS）。它是轉(zhuǎn)錄后基因沉默（posttranscriptional gene silencing，PTGS）一種特殊形式。但是，為利于病毒侵染，植物病毒也同時(shí)編碼一種蛋白用來(lái)對(duì)抗RNAi，這類(lèi)蛋白可以用于抑制RNA沉默的各個(gè)步驟，稱(chēng)為 RNAi 抑制因子［2］。據(jù)報(bào)道已鑒定了50余種病毒編碼的RSS，例如馬鈴薯Y病毒屬（Potyvirus）中的蚜傳輔助性蛋白酶（help component-proteinase，HC-Pro）［3］，黃瓜花葉病毒（Cucumber mosaic virus，CMV）編碼的2b，馬鈴薯X 病毒（Potato virus X，PXV）編碼的p25、馬鈴薯卷葉病毒（Potato leafroll virus，PLRV）屬編碼的P0以及甘蔗黃葉病毒編碼（Sugarcane yellow leaf virus，SCYLV）的 P0 等［4］。

基因沉默抑制因子干擾基因沉默的機(jī)制有多種形式：抑制siRNA的積累；抑制因子與siRNA的結(jié)合，使之不能與蛋白核酸復(fù)合體結(jié)合形成RISC（RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合物）；抑制雙鏈RNA的形成；抑制因子與基因沉默核酸蛋白復(fù)合體相結(jié)合，阻止轉(zhuǎn)錄后基因沉默的發(fā)生。AGO蛋白是RNA沉默途徑中一個(gè)關(guān)鍵蛋白，AGO蛋白可以與小RNA的引導(dǎo)鏈及其他蛋白質(zhì)組裝形成的RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合體（RISC）。病毒編碼的RSS與AGO相互作用的研究表明，AGO作為RNA沉默路徑當(dāng)中的關(guān)鍵蛋白可能會(huì)成為很多病毒RSS作用的靶位點(diǎn)，AGO蛋白正確組裝成RISC需要多種dsRNA結(jié)合蛋白的協(xié)助，因此推測(cè)許多RSS利用其含有的“AGO 鉤”（GW/WG重復(fù)，甚至只含有單個(gè)GW或WG）與AGO的競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合來(lái)抑制RNA沉默。最新研究發(fā)現(xiàn)，抑制因子中含有的重復(fù)甘氨酸、色氨酸（GW/WG motif）是與AGO相互作用的關(guān)鍵氨基酸，基因序列中GW/WG重復(fù)二次至多次可以作為“AGO鉤”（Ago hook）與AGO蛋白結(jié)合并在基因沉默中發(fā)揮作用［5，6］。例如蕪箐鄒縮病毒（TCV）外殼蛋白P38中的二個(gè)GW重復(fù)是與AGO相互作用的關(guān)鍵氨基酸，而且P38與AGO互作的同時(shí)會(huì)影響DCL的表達(dá)［7］。

馬鈴薯卷葉病毒屬于黃癥病毒科家族的馬鈴薯卷葉病毒屬中的黃化病毒組（Luteovirus），1916年被發(fā)現(xiàn)，是發(fā)現(xiàn)最早的馬鈴薯病毒，由多種蚜蟲(chóng)以持久性方式傳播，而不能由機(jī)械傳播，PLRV的分布主要局限于在寄主植株韌皮部維管束內(nèi)，主要侵染茄科（如馬鈴薯、番茄等）植物。據(jù)報(bào)道，在我國(guó)北方地區(qū)造成的馬鈴薯產(chǎn)量的損失約為30%-40%，嚴(yán)重時(shí)候可達(dá)到80%-90%。PLRV基因組結(jié)構(gòu)為等軸對(duì)稱(chēng)，直徑約24 nm。PLRV的RNA的堿基組成大體上為28%A、23%U、25%C與24%G。PLRV的基因組含有8個(gè)ORFs，其中有部分ORF重疊，在通過(guò)選擇性的識(shí)別起始密碼后再經(jīng)過(guò)移碼、通讀終止密碼子及利用亞基因組等各種策略分別翻譯各 ORF［8］（圖 1）。P0是由 PLRV的 ORF1所編碼，它是病毒侵染植株后引起病癥的決定性因子，并且是一種RSS。

圖1 馬鈴薯卷葉病毒基因組結(jié)構(gòu)

目前已鑒定的馬鈴薯卷葉病毒屬中的RSS只有馬鈴薯卷葉病毒（PLRV）、甜菜西方黃化病毒（BWYV）、南瓜蚜傳黃化病毒（CABYV）和甜瓜蚜傳黃化病毒（MABYV）編碼的P0蛋白，但對(duì)其機(jī)制都還不清楚，而我們?cè)噲D通過(guò)農(nóng)桿菌瞬時(shí)表達(dá)滲透注射轉(zhuǎn)GFP基因的16c煙草葉片研究PLRV-P0是否能抑制RNA沉默。通過(guò)序列分析發(fā)現(xiàn)P0基因序列中含有兩個(gè)重復(fù)的WG基序，我們首先將P0基因序列中第87位和第140位的色氨酸（W）點(diǎn)突變?yōu)楸彼幔ˋ）（命名為P0WA），然后分別將P0和P0WA基因克隆到改造后的雙分子熒光互補(bǔ)載體pCAMBIA1300-CE上， 將 PLRV-P0，PLRV-P0WA分別和AGO共同進(jìn)行農(nóng)桿菌滲透注射野生型（N.ben）煙草葉片，并在熒光顯微鏡下觀察PLRV-P0和AGO及PLRV-P0WA和AGO共同注射后是否有綠色熒光的出現(xiàn)，從而確定PLRV-P0到底能否和AGO蛋白發(fā)生相互作用及其關(guān)鍵氨基酸。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料 本氏煙草（Nicotiana benthamiana）以及轉(zhuǎn)GFP基因的（16c）煙草種子由David Baulcombe教授惠贈(zèng)。

1.1.2 菌種、質(zhì)粒 大腸桿菌DH5α，農(nóng)桿菌GV3101，pWEIMING101載體均由本實(shí)驗(yàn)室保存，雙分子熒光互補(bǔ)載體pCAMBIA1300-CE以及重組質(zhì)粒 ASK-NE，ASK-CE，AGO-NE，pGR107P0WA均由本實(shí)驗(yàn)其他研究人員構(gòu)建。

1.1.3 酶和試劑 限制性?xún)?nèi)切酶（XhoI，ClaI，SalI，KpnI）和T4 DNA連接酶購(gòu)自Promega公司；TaqDNA聚合酶及其緩沖液，dNTP購(gòu)自TakaRa公司；膠回收試劑盒，質(zhì)?？焖偬崛≡噭┖匈?gòu)自北京康潤(rùn)誠(chéng)業(yè)生物科技有限公司；DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)購(gòu)自Fermentas公司，其他生化試劑均為進(jìn)口或國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計(jì)與合成 根據(jù)GenBank中報(bào)道的PLRV-P0的基因序列，設(shè)計(jì)合成含有相關(guān)酶切位點(diǎn)的上下游引物并由上海生工生物工程公司合成。

1.2.2 目的基因的PCR擴(kuò)增

1.2.2.1 P0基因的PCR擴(kuò)增 以pER8的cDNA為模 板，PLRV-P0 5'：GTTAGTCGACATGATTGTATTGACCCAGTCTG（下劃線(xiàn)為SalI酶切位點(diǎn)）；PLRVP0 3'：ACAGGGTACCTCATTCTTGTAATTCCTTTTGG（下劃線(xiàn)為KpnI酶切位點(diǎn)），1300-CE-P0 5'：GTTAATCGATATGATTGTATTGACCCAGTC（ 下 劃 線(xiàn) 為ClaI酶切位點(diǎn)）；1300-CE-P0 3'：CACACTCGAGTTCTTGTAATTCCTTTTGGA（下劃線(xiàn)為XhoI酶切位點(diǎn)）為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系為：pER8的cDNA 模板 1 μL，10 × PCR Buffer 5 μL（含 Mg2+），2.5 mmol/L 的dNTP 4 μL，10 μmol/L上下游引物各1 μL，TaqDNA聚合酶 1 μL，Pfu 0.5 μL，加去離子水至總體積為50 μL。PCR反應(yīng)程序：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性 30 s，55℃退火 30 s，72℃延伸 45 s，共30個(gè)循環(huán)；72℃延伸5 min。然后用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè) PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物，膠回收試劑盒切膠回收PCR產(chǎn)物并瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

1.2.2.2 P0WA基因的PCR擴(kuò)增 PLRV-P0的第87-140位氨基酸的原序列如下（方框內(nèi)為兩個(gè)WG基序 ）：WGLLCGTHPAIQIVGLTIVIKLDDPTTAAAYRSELLRVSSSSYIQNAAGLSNGWG 。

以重組質(zhì)粒pGR107P0WA為模板PCR擴(kuò)增，將PLRV-P0的第87、140位的色氨酸（W）點(diǎn)突變丙氨酸（A），突變之后的序列如下（方框內(nèi)為兩個(gè)WG基 序 突 變 后 ）：AGLLCGTHPAIQIVGLTIVIKLDDPTTAAAYRSELLRVSSSSYIQNAAGLSNGAG 。

以pGR107-P0WA質(zhì)粒為模板，1300-CE-P0W-A 5'：GTTAATCGATATGATTGTATTGACCCAGTC（ 下劃線(xiàn)為ClaI酶切位點(diǎn)）；1300-CE-P0WA 3'：CACACTCGAGTTCTTGTAATTCCTTTTGGA（下劃線(xiàn)為XhoI酶切位點(diǎn)）為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系為：pGR107-P0WA質(zhì)粒DNA模板1 μL，10×PCR Buffer 5 μL（含Mg2+），2.5 mmol/L的dNTP 4 μL，10 μmol/L上下游引物各 1 μL，TaqDNA聚合酶 1 μL，Pfu 0.5μL，加去離子水至總體積為50 μL。PCR反應(yīng)程序：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸45 s，共30個(gè)循環(huán)；72℃延伸5 min。然后用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè) PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物，膠回收試劑盒切膠回收PCR產(chǎn)物并用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

1.2.3 植物表達(dá)載體的構(gòu)建 將純化后的P0基因片段與質(zhì)粒pWM101分別用限制性?xún)?nèi)切酶SalI和KpnI進(jìn)行雙酶切；然后用限制性?xún)?nèi)切酶ClaI和XhoI對(duì)P0，P0WA基因進(jìn)行雙酶切；最后用限制性?xún)?nèi)切酶ClaI，SalI對(duì)質(zhì)粒載體pCAMBIA1300-CE進(jìn)行酶切。酶切后產(chǎn)物用膠回收試劑盒進(jìn)行回收，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)回收產(chǎn)物，根據(jù)外源片段和載體DNA條帶亮度以等摩爾比例用T4 DNA連接酶16℃過(guò)夜連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，涂布于含卡那霉素（Kan）的LB培養(yǎng)基平板上，37℃倒置培養(yǎng)12-16 h，挑取單菌落37℃恒溫振蕩培養(yǎng)12-16 h，以菌落為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，根據(jù)菌落PCR結(jié)果對(duì)號(hào)提取重組質(zhì)粒，然后進(jìn)行質(zhì)粒PCR和雙酶切鑒定，取1 mL菌液送交測(cè)序公司進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果與所設(shè)計(jì)的目的基因序列進(jìn)行比對(duì)。

1.2.4 農(nóng)桿菌的轉(zhuǎn)化 取5 μL重組質(zhì)粒加入到100μL農(nóng)桿菌GV3101感受態(tài)細(xì)胞中，用移液槍迅速吹打混勻后置于冰上3-5 min，然后把混合物貼著電擊杯壁緩慢加入，預(yù)激（參數(shù)：電壓2.2 kV，電容25μF，阻抗200 Ω）電激儀，再將電激杯至于電激儀中進(jìn)行電激脈沖放電，電激結(jié)束后吸出電激混合液到微量離心管中，加入600 μL的LB液體培養(yǎng)基（含50 mg/L Kan，50 mg/L Rif，5 mg/L Tet），28℃條件下靜置3 h，室溫5 000 r/min離心5 min，取100 μL菌液涂布于LB固體培養(yǎng)基（含50 mg/L Kan，50 mg/L Rif，5 mg/L Tet）平板上，28℃倒置培養(yǎng)30-40 h，并對(duì)長(zhǎng)出的菌落進(jìn)行菌落PCR鑒定。

1.2.5 煙草的侵染 挑選5-6葉期的野生型煙草和轉(zhuǎn)GFP基因的16c煙草幼苗用于農(nóng)桿菌的侵染。從LB（含 50 mg/L Kan，50 mg/L Rif，5 mg/L Tet）固體培養(yǎng)基上挑取重組單菌落，接種到5 mL的LB（50 mg/L Kan，50 mg/L Rif，5 mg/L Tet）液體培養(yǎng)基中，28℃，180 r/min恒溫振蕩培養(yǎng)24-28 h。按1∶100的比例把菌液轉(zhuǎn)接到20 mL的LB（50 mg/L Kan，50 mg/L Rif，5 mg/L Tet）液體培養(yǎng)基中，同時(shí)在培養(yǎng)基中加入終濃度為100 mmol/L的乙磺酸（MES）和終濃度為20 μmol/L的乙酰丁香酮（Acetosyringone，AS），于28℃，180 r/min振蕩培養(yǎng)16-18 h，然后于4℃5 000 r/min離心5 min，棄上清，收集菌體。用農(nóng)桿菌滲透緩沖液（含MES、AS、MgCl2，終濃度分別為100 mmol/L，20 μmol/L的和100 mmol/L）懸浮沉淀，稀釋至OD600nm值為1.0，室溫下靜置懸浮3 h，用已消毒的一次性注射器將農(nóng)桿菌滲透液注射到煙草葉片葉脈的兩側(cè)，注射完畢后，將煙草置于28℃恒溫培養(yǎng)室中光照16 h，黑暗8 h培養(yǎng)。

1.2.6 煙草葉片的觀察 將煙草葉片放于暗室中用紫外燈照射觀察基因沉默現(xiàn)象并用相機(jī)拍照記錄。選取滲透注射過(guò)的煙草葉片，用剪刀沿葉脈剪下葉片。制作玻片標(biāo)本：用潔凈的紗布把載玻片、蓋玻片擦拭干凈；在載玻片的中央滴一滴清水；用鑷子夾取葉片浸入玻片中央的水滴中；展平葉片；用鑷子夾取蓋玻片，使它的一邊先接觸載玻片上的水滴，然后輕輕蓋在葉片上。奧林巴斯BX51熒光顯微鏡觀察煙草葉片并拍照記錄。

2 結(jié)果

2.1 目的基因的PCR擴(kuò)增

以pER8的cDNA為模板，PCR擴(kuò)增PLRV-P0目的基因；以重組質(zhì)粒pGR107P0WA為模板，PCR擴(kuò)增PLRV-P0WA目的基因，1%瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果（圖2）顯示，成功擴(kuò)增出約為700 bp的片段，與預(yù)期結(jié)果大小一致。

2.2 植物表達(dá)載體的構(gòu)建

圖2 P0（P0WA）基因的PCR擴(kuò)增

將質(zhì)粒載體pWEIMING101（SalI，KpnI），pCAMBIA 1300-CE（ClaI，SalI）和目的基因片段P0（SalI，KpnI；ClaI，XhoI），P0WA（ClaI，XhoI）進(jìn)行雙酶切，然后用T4 DNA連接酶將載體和目的基因片段連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α得到重組質(zhì)粒。經(jīng)菌落PCR擴(kuò)增檢測(cè)呈陽(yáng)性的克隆分別提取質(zhì)粒進(jìn)行了質(zhì)粒PCR，并對(duì)重組質(zhì)粒pWEIMING101-P0（SalI，KpnI），pCAMBIA1300-CE-P0（P0WA）（ClaI，Sa lI）進(jìn)行雙酶切鑒定，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)圖譜中呈現(xiàn)700 bp的目的基因條帶，與預(yù)期結(jié)果一致（圖3，圖4），測(cè)序結(jié)果表明插入片段長(zhǎng)度為700 bp，與載體的連接方向正確，植物表達(dá)載體符合要求（圖5，圖 6）。

圖3 重組質(zhì)粒pWEIMING101-P0雙酶切鑒定

圖4 重組質(zhì)粒pCAMBIA1300-CE-P0（P0WA）雙酶切鑒定

圖5 pWEIMING101-P0植物表達(dá)載體的構(gòu)建

2.3 PLRV-P0抑制RNA基因沉默

將重組質(zhì)粒pWEIMING101-P0電擊轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌GV3101，同時(shí)與GFP等體積混合共同滲透注射轉(zhuǎn)GFP基因的（16c）煙草葉片。單獨(dú)滲透注射含GFP基因的農(nóng)桿菌菌液作為陰性對(duì)照，等體積混合滲透注射含GFP和T2b基因的農(nóng)桿菌菌液作為陽(yáng)性對(duì)照，暗室中紫外燈下觀察發(fā)現(xiàn)在滲透注射后的第6天等體積混合GFP和PLRV-P0的農(nóng)桿菌菌液共同注射的煙草葉片中有很強(qiáng)的綠色熒光出現(xiàn)，而單獨(dú)滲透注射GFP的葉片中則沒(méi)有綠色熒光的出現(xiàn)（圖7）。研究表明PLRV-P0確實(shí)能抑制GFP mRNA引起的基因沉默。

為了保證試驗(yàn)的可靠性，每個(gè)試驗(yàn)組合滲透注射50片煙草葉片，并重復(fù)至少3次，共150片葉片，第6天在紫外燈下觀察并進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，如表1。經(jīng)分析表明PLRV-P0能抑制GFP mRNA引起的基因沉默。

圖6 pCAMBIA1300-CE-P0（P0WA）植物表達(dá)載體的構(gòu)建

圖7 PLRV-P0抑制RNA基因沉默的鑒定

2.4 PLRV-P0和AGO相互作用熒光觀察

利用農(nóng)桿菌滲透注射技術(shù)把制備好的滲透注射液 分 別 以 ASK-NE+ASK-CE，P0-CE+AGO-NE，P0WACE+AGO-NE，P0-NE+AGO-CE，1300-CE+AGO-NE，1300-CE+1300-NE滲透注射液組合注射本氏（Nicoti-ana benthamiana）煙草葉片。注射完畢以后，將煙草置于28℃的培養(yǎng)室中進(jìn)行培養(yǎng)。逐日獲取注射葉片在奧林巴斯BX51熒光顯微鏡下觀察。前期試驗(yàn)過(guò)程中發(fā)現(xiàn)ASK-NE+ASK-CE滲透注射煙草的第2、3天能夠發(fā)出很強(qiáng)的熒光，因此這里用它作為陽(yáng)性對(duì)照，為了排除了YFP的N末端和C末端單獨(dú)作用，設(shè)置了1300-CE+1300-NE為陰性對(duì)照。在滲透注射后的第24、36、48、60、72及96 h分別取材進(jìn)行熒光顯微鏡觀察，通過(guò)觀察發(fā)現(xiàn)，在36 h時(shí)開(kāi)始出現(xiàn)熒光，在48 h已經(jīng)有大量熒光的表達(dá)，60 h仍然有熒光存在，但明顯不如48 h時(shí)亮，72 h時(shí)只有少量熒光表達(dá)（圖8）。每組試驗(yàn)滲透注射10片葉片，重復(fù)至少3次，數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)結(jié)果如表2所示，統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明P0能夠與AGO1發(fā)生相互作用，產(chǎn)生熒光。在第48 h時(shí)對(duì)所觀察到的熒光用奧林巴斯BX51系統(tǒng)照相，ASK-NE+ASK-CE有大量的綠色熒光，說(shuō)明試驗(yàn)基本操作正確；P0-CE+AGO-NE有綠色熒光的出現(xiàn)，說(shuō)明P0能夠和AGO蛋白發(fā)生相互作用；P0-CE+1300-NE、1300-CE+AGO-NE、1300-CE+1300-NE均沒(méi)有綠色熒光的出現(xiàn)，分別排除了P0和NE，AGO和CE，CE和NE相互作用的可能性。這些結(jié)果表明，PLRV-P0確實(shí)能夠和AGO蛋白發(fā)生相互作用。

表1 PLRV-P0抑制RNA沉默數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

圖8 PLRV-P0和AGO相互作用的熒光觀察

3 討論

目前已鑒定的馬鈴薯卷葉病毒屬中的RSS只有馬鈴薯卷葉病毒，甜菜西方黃化病毒，南瓜蚜傳黃化病毒和甜瓜蚜傳黃化病毒（MABYV）編碼的P0蛋白，但對(duì)其機(jī)制都還不清楚，而我們通過(guò)研究驗(yàn)證了PLRV-P0確實(shí)能抑制RNA沉默。這對(duì)PLRVP0的抑制機(jī)制的研究有著重要的意義。

新近研究發(fā)現(xiàn)，一些抑制因子中含有的重復(fù)甘氨酸、色氨酸（GW/WG motif）是與AGO相互作用的關(guān)鍵氨基酸，序列中GW/WG重復(fù)二次至多次可以作為“AGO鉤”（Ago hook）與AGO蛋白結(jié)合并在基因沉默中發(fā)揮作用，這類(lèi)抑制因子廣泛存在于酵母、植物和動(dòng)物的細(xì)胞中［6］。例如，新近的研究發(fā)現(xiàn)蕪箐鄒縮病毒（TCV）外殼蛋白P38中的二個(gè)GW重復(fù)是與AGO相互作用的關(guān)鍵氨基酸，P38與AGO的相互作用同時(shí)影響DCL的表達(dá)［7］。我們通過(guò)序列分析首先發(fā)現(xiàn)，P0基因序列中含有兩個(gè)重復(fù)的WG基序，而WG基序可以作為AGO鉤和AGO蛋白結(jié)合，所以P0可能是通過(guò)與AGO結(jié)合抑制RNA沉默，熒光互作試驗(yàn)結(jié)果證明，P0蛋白確實(shí)能夠和AGO蛋白發(fā)生相互作用，PLRV-P0的兩個(gè)重復(fù)的WG基序是其與AGO蛋白發(fā)生相互作用的關(guān)鍵氨基酸。

表2 滲透注射的煙草葉片出現(xiàn)熒光的時(shí)間

已有研究報(bào)道，有些病毒可以通過(guò)與AGO蛋白結(jié)合，并進(jìn)一步作用于其下游的F-box泛素降解途徑，從而抑制RNA沉默。在PLRV-P0的研究中，我們已經(jīng)證明了P0確實(shí)能和AGO蛋白結(jié)合，但究竟其是不是通過(guò)進(jìn)一步作用于F-box泛素降解途徑還有待于進(jìn)一步驗(yàn)證。另外，我們?cè)噲D通過(guò)Pull down和Western blot分子驗(yàn)證，證明PLRV-P0確實(shí)和AGO蛋白相互作用，并通過(guò)其結(jié)合抑制RNA沉默。但是，PLRV-P0蛋白和AGO相互作用觀察過(guò)程中，熒光顯微鏡下觀察到的熒光很少，提取的總蛋白中互作的蛋白也很少，因此Pull down 和Western blot檢測(cè)過(guò)程中還沒(méi)有得到預(yù)期結(jié)果，可能正是因?yàn)镻LRV-P0和AGO結(jié)合后，作用于F-box泛素降解途徑引起了AGO的降解，所以才導(dǎo)致這種情況的出現(xiàn)。

4 結(jié)論

馬鈴薯卷葉病毒運(yùn)動(dòng)蛋白的P0蛋白是一個(gè)RNA沉默抑制因子，它可以抑制由GFP的mRNA引起的基因沉默；P0蛋白抑制GFP mRNA基因沉默的機(jī)制是通過(guò)與AGO蛋白的相互作用，其關(guān)鍵氨基酸是P0蛋白的WG基序。

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