糖尿病早期大鼠血清代謝輪廓的變化

朱環(huán)，管咪咪，鄭涌泉，王娜，宋毅果，王亞強(qiáng)，鄧明捷，高紅昌

（溫州醫(yī)科大學(xué) 藥學(xué)院代謝組學(xué)與醫(yī)藥核磁共振研究所，浙江 溫州 325035）

糖尿?。╠iabetes mellitus，DM）主要分為1型和2型[1]。1型DM是由于胰島素細(xì)胞被破壞而引起的[2]。鏈脲佐菌素（streptozocin，STZ）能夠選擇性破壞胰島β細(xì)胞使血糖升高而出現(xiàn)臨床DM患者的癥狀。目前雖有研究DM糖類代謝物變化的報(bào)道[3]，但DM引起的整體代謝物的變化規(guī)律還不清楚。代謝組學(xué)是研究生物體內(nèi)源性代謝物的整體及其受內(nèi)在或外在因素影響而變化的科學(xué)[4]，非常適合疾病的代謝輪廓和發(fā)病機(jī)制研究[5]。因此本研究通過(guò)大鼠STZ造模后，再利用基于核磁共振（NMR）的代謝組學(xué)方法分析血清的整體代謝特征，這可能為闡明1型DM潛在發(fā)病機(jī)制提供重要的線索。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 雄性SD大鼠購(gòu)自上海斯萊克動(dòng)物實(shí)驗(yàn)有限公司，8周齡，（150±15）g，飼養(yǎng)于溫州醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心SPF級(jí)動(dòng)物房，從早上8:00開(kāi)始12 h交替照明。所有大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周再進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)期間大鼠自由飲水、進(jìn)食。所有的操作程序嚴(yán)格遵守NIH的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)和使用手冊(cè)。

1.2 試劑與儀器 STZ購(gòu)自Sigma-Aldrich公司；枸櫞酸、枸櫞酸鈉、水合氯醛購(gòu)于上海國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；D2O（99.9%氘代）購(gòu)于劍橋同位素實(shí)驗(yàn)室；純水由Milli-Q超純水系統(tǒng)（Millipore，Billerica，MA，USA）生產(chǎn)。Bruker AVANCE III 600 MHz核磁共振譜儀（Bruker BioSpin International AG）；低溫離心機(jī)5415R（eppendorf Inc，Germany）。

1.3 造模方法 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分為對(duì)照組和DM組，DM組大鼠注射新鮮配制的STZ枸櫞酸鈉混懸溶液（70 mg/kg，腹腔注射），對(duì)照組大鼠給予同體積的枸櫞酸鈉混懸溶液（0.10 mol/L，pH 4.5）。給予STZ 3 d后測(cè)其血糖水平，選取血糖值大于16.70 mmol/L的大鼠作為DM大鼠。

1.4 血清樣品的制備與1H NMR譜數(shù)據(jù)的獲得 大鼠造模5周后禁食12 h，收集血液。將血液進(jìn)行離心（3000 r/min，4 ℃，15 min），取上清液，保存于-80 ℃冰箱。NMR數(shù)據(jù)分析之前，血清樣品解凍，取200μL血清中加入400μL磷酸緩沖液（0.2 mol/L Na2HPO4/0.2 mol/L NaH2PO4，pH 7.4）以降低pH值的變化，并加入60μL含3-甲基硅烷-2，2’，3，3’-d（4）丙酸鈉（TSP）濃度為0.2 mmol/L的重水（D2O）用于鎖場(chǎng)。在12000 g，10 min，4 ℃條件下，離心去除樣品中的沉淀。取500μL上清液移入直徑為5 mm的NMR樣品管中。所有的1H NMR譜圖均在Bruker AVANCE III 600 MHz超導(dǎo)高分辨核磁共振譜儀上進(jìn)行檢測(cè)，采樣溫度為25 ℃，1H的共振頻率為600.13 MHz，配有三共振探頭和Z軸的脈沖場(chǎng)梯度。血清樣品一維自旋回波譜用CPMG序列來(lái)采譜D-[-90°-（τ-180-τ-）n-ACQ，總的自旋回波時(shí)間2 nτ為120 ms，用于減弱轉(zhuǎn)動(dòng)較慢的大分子信號(hào)，保留小分子和脂類分子的信號(hào)。64次累加和數(shù)據(jù)采集點(diǎn)為32 K，譜寬12000 Hz，弛豫延遲4 s；在進(jìn)行傅立葉變換之前，采集的FID信號(hào)充零至64 K，并加窗函數(shù)0.3 Hz。所有的1H NMR譜圖都進(jìn)行了細(xì)致的相位校正和基線調(diào)整，并參考乳酸的甲基峰（CH3，δ1.33）來(lái)定標(biāo)。

1.5 NMR波譜數(shù)據(jù)處理和模式分析 為了得到全部代謝物的信息，使用Bruker Topspin 2.1軟件包對(duì)采集的1H NMR譜進(jìn)行相位校正和基線調(diào)整，將1H NMR譜從δ10.0～0.4 ppm分別按0.01 ppm和0.0015 ppm為單位進(jìn)行自動(dòng)分段積分，為了消除飽和水峰時(shí)引起的譜線扭曲，將δ5.2～4.4 ppm區(qū)域設(shè)為0積分段。為補(bǔ)償樣品之間濃度的差異，對(duì)每一段積分值都相對(duì)于該譜的所有積分值進(jìn)行歸一化，然后將以0.01 ppm為區(qū)間歸一化后得到的數(shù)據(jù)導(dǎo)入SIMCAP+12.0軟件包（瑞典Umetrics公司），進(jìn)行多元統(tǒng)計(jì)分析。偏最小二乘判別分析（partial least-squares discriminant analysis，PLS-DA）的所有的樣品點(diǎn)都展示在第一和第二個(gè)主成分（PC1和PC2）為x、y坐標(biāo)軸的二維空間中，該圖中的每一個(gè)點(diǎn)都代表一個(gè)血清樣品。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法 歸一化后的積分值導(dǎo)入SPSS 13.0軟件作統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。兩組樣品間的比較采用獨(dú)立樣品的t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 造模結(jié)果 對(duì)照組生長(zhǎng)發(fā)育良好，而DM組大鼠體質(zhì)量明顯下降；對(duì)照組大鼠精神狀態(tài)良好，被毛潔白有光澤，DM組被毛粗糙發(fā)黃，黯淡無(wú)光澤；對(duì)照組大鼠的食量、飲水量、尿量與實(shí)驗(yàn)前相比無(wú)明顯變化，而DM組大鼠明顯出現(xiàn)多尿現(xiàn)象，并且飲水量和食量都明顯增加，為保證其飲水量的充足，一天需要多次加水。造模成功后，每周我們都對(duì)大鼠的隨機(jī)血糖進(jìn)行檢測(cè)，對(duì)照組大鼠血糖在正常范圍內(nèi)，波動(dòng)少，而DM組大鼠的隨機(jī)血糖均大于16.7 mmol/L，并且隨著時(shí)間推移血糖日益升高。直至造模后第5周，剩余對(duì)照組大鼠數(shù)量n=7，DM組大鼠數(shù)量n=7。

2.2 血清1H NMR圖譜的分析 圖1是典型的對(duì)照組大鼠和DM大鼠血清的1H CPMG譜，圖中標(biāo)注的代謝物是通過(guò)結(jié)合文獻(xiàn)[6]報(bào)道，chemx6.0軟件以及我們已有的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)[5]完成的。我們檢測(cè)了以下代謝物：甲酸（formate，δ8.45），苯丙氨酸（phenylalanine，δ7.37），酪氨酸（tyrosine，δ7.18），組氨酸（histidine，δ7.07），α-葡萄糖（α-glucose，δ5.23），β-葡萄糖（β-glucose，δ4.65），甘油（glycerol，δ3.68），甘氨酸（glycine，δ3.56），膽堿（choline，δ3.22），肌酸（creatine，δ3.03），天冬氨酸（aspartate，δ2.87），枸櫞酸（citrate，δ2.53），谷氨酰胺（glutamine，δ2.44），N-乙酰糖蛋白（NAG，δ2.02），氧化三甲胺（TMAO，δ3.26），丙酮酸（pyruvate，δ2.37），3-羥基丁酸（3-HB） （3-hydroxybutyrate，δ2.30），乙酰乙酸（acetoacetate，δ2.28），丙酮（acetone，δ2.23），乙酸（acetate，δ1.91），丙氨酸（alanine，δ1.47），乳酸（lactate，δ1.33），纈氨酸（valine，δ1.03），異亮氨酸（isoleucine，δ1.00），亮氨酸（leucine，δ0.96），低密度脂蛋白/極低密度脂蛋白（LDL/VLDL，δ0.86）。

2.3 模式識(shí)別分析結(jié)果 如圖2，我們從PLS-DA得分圖上可以發(fā)現(xiàn)DM大鼠與對(duì)照組大鼠血清樣品在第一主成分上能明顯區(qū)分開(kāi)（見(jiàn)圖2A，R2=87.8%，Q2=78.4%），因此推測(cè)DM大鼠與對(duì)照組大鼠的代謝輪廓是不同的。從相對(duì)應(yīng)的載荷圖（見(jiàn)圖2B）可以發(fā)現(xiàn)，葡萄糖、膽堿、肌酸、乳酸、3-HB、LDL/VLDL對(duì)兩組的區(qū)分貢獻(xiàn)較大。

圖1 對(duì)照組大鼠(A)和DM大鼠(B) 血清典型的1H CPMG NMR譜

圖2 模式識(shí)別分析結(jié)果

2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析結(jié)果 相比對(duì)照組大鼠，DM大鼠中β-葡萄糖和甘油水平顯著升高（P＜0.05，P＜0.01）；而酪氨酸、甘氨酸、膽堿、谷氨酰胺、丙酮酸、3-HB、乳酸、丙酮和LDL/VLDL顯著降低（P＜0.01或P＜0.05），其他代謝物組間差異不存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。詳見(jiàn)表1。

3 討論

表1 對(duì)照組和DM組大鼠t檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析結(jié)果

DM的病理生理機(jī)制比較復(fù)雜，其疾病基礎(chǔ)是糖代謝紊亂、血流動(dòng)力學(xué)異常、胰島素抵抗和炎性遞質(zhì)活化，但是關(guān)于其發(fā)病機(jī)制仍知之甚少。研究表明1型DM動(dòng)物缺乏胰島素，因而導(dǎo)致對(duì)葡萄糖攝取和利用不足[7]。在本研究中，與對(duì)照組大鼠相比，DM早期大鼠β-葡萄糖含量明顯升高（血糖明顯升高的重要原因），推測(cè)是由于機(jī)體對(duì)葡萄糖等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的攝取利用不足所造成的，說(shuō)明DM大鼠的糖代謝紊亂，符合DM的已知病因和診斷[8]。以上觀點(diǎn)從3-HB的降低得以印證，當(dāng)葡萄糖來(lái)源受限時(shí)，3-HB將被作為一種能源替代物[9]，它能夠作為能量物質(zhì)以應(yīng)對(duì)DM機(jī)體對(duì)葡萄糖利用的不足。此外，為了應(yīng)對(duì)葡萄糖利用不足而導(dǎo)致的能量缺乏，乳酸會(huì)被氧化成丙酮酸而進(jìn)入三羧酸循環(huán)（TCA），從而提供大量的能源，這可能就是DM大鼠乳酸顯著性降低的原因之一。丙酮酸，作為重要的糖酵解產(chǎn)物，能被轉(zhuǎn)化為乙酰輔酶A進(jìn)而參與TCA。本研究中觀察到DM大鼠丙酮酸顯著性降低，反映出DM早期大鼠TCA程度會(huì)增強(qiáng)，從而導(dǎo)致丙酮酸的大量消耗，加速機(jī)體將蛋白質(zhì)和脂肪轉(zhuǎn)換為丙酮酸。能源物質(zhì)利用的不足，加之TCA程度的增強(qiáng)而致機(jī)體能量大量流失，正是DM大鼠機(jī)體迅速消瘦的重要原因。

甘氨酸為體內(nèi)非必需氨基酸，由葡萄糖轉(zhuǎn)變而來(lái)，本研究中發(fā)現(xiàn)DM大鼠甘氨酸顯著性降低，這可能正是機(jī)體對(duì)葡萄糖的利用不足所致。谷氨酰胺是人體含量最豐富的氨基酸，作為糖代謝和氨基酸代謝的重要中間體，谷氨酰胺能夠減輕急性腎小管損傷[10]。因此，其濃度降低反映出DM早期機(jī)體能為減輕高血糖腎損傷而做出反應(yīng)。含苯基的化合物主要是由腸道內(nèi)的菌群代謝產(chǎn)生（如酪氨酸），主要是食物中的多酚和食物蛋白分解出來(lái)[11]，酪氨酸的減少表明DM大鼠腸道內(nèi)的菌群代謝發(fā)生紊亂。另外，DM大鼠在飲食、消化、吸收各方面受到影響，這可能也是各種氨基酸含量普遍降低的原因[12]。

膽堿是細(xì)胞膜的組成成分并參與脂類代謝[13]。DM大鼠膽堿的降低，可能由于DM發(fā)病過(guò)程中的炎癥反應(yīng)導(dǎo)致機(jī)體細(xì)胞再生受到抑制。甘油主要的產(chǎn)生器官是肝臟，巨噬細(xì)胞和血管平滑肌細(xì)胞能夠?qū)⑵湮詹⑶宄齕14]，DM大鼠甘油的顯著性降低，是由于體內(nèi)產(chǎn)生大量的巨噬細(xì)胞對(duì)DM炎癥做出的保護(hù)性反應(yīng)。DM大鼠血清中LDL/VLDL含量減少，這提示DM肝細(xì)胞內(nèi)正常的脂類代謝被破壞。然而也有文獻(xiàn)報(bào)道LDL/VLDL含量在DM中是升高的[7]，這可能是由于其檢測(cè)的樣品是尿液或者動(dòng)物處于不同的DM時(shí)期所致。酮體包括丙酮、乙酰乙酸和3-HB，也是脂肪酸的代謝產(chǎn)物。實(shí)驗(yàn)中我們觀察到DM大鼠丙酮和3-HB顯著性降低，這與文獻(xiàn)[15]報(bào)道的Zucker肥胖大鼠代謝結(jié)果一致。這些酮體濃度降低提示了DM導(dǎo)致的線粒體功能障礙會(huì)引起脂肪酸氧化作用紊亂。

本研究應(yīng)用代謝組學(xué)方法展示了DM早期大鼠血清的代謝物變化，揭示了其糖代謝、氨基酸代謝以及脂類代謝發(fā)生紊亂的分子機(jī)制，這為進(jìn)一步研究DM的代謝特征提供了線索。

[1] 張瑩瑩, 于捷, 周旋, 等. 復(fù)方降糖茶對(duì)STZ 誘導(dǎo)的糖尿病大鼠的治療作用及其可能機(jī)制[J]. 溫州醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào), 2011, 41(3): 224-227.

[2] Li Y, Hamasaki T, Teruya K, et al. Suppressive effects of natural reduced waters on alloxan-induced apoptosis and type 1 diabetes mellitus[J]. Cytotechnology, 2012, 64(3): 281-297.

[3] Zhang X, Wang Y, Hao F, et al. Human serum metabonomic analysis reveals progression axes for glucose intolerance and insulin resistance statuses[J]. J Proteome Res, 2009, 8(11): 5188-5195.

[4] 夏建飛, 梁瓊麟, 胡坪, 等. 代謝組學(xué)研究策略與方法的新進(jìn)展[J]. 分析化學(xué), 2009, 37(1): 136-143.

[5] Gao H, Dong B, Liu X, et al. Metabonomic profiling of renal cell carcinoma: high-resolution proton nuclear magnetic resonance spectroscopy of human serum with multivariate data analysis[J]. Anal Chim Acta, 2008, 624(2): 269-277.

[6] Zhang H, Jia J, Cheng J, et al.1H NMR-based metabonomics study on serum of renal interstitial fibrosis rats induced by unilateral ureteral obstruction[J]. Mol Biosyst, 2012, 8(2):595-601.

[7] Zhao L, Gao H, Lian F, et al.1H-NMR-based metabonomic analysis of metabolic profiling in diabetic nephropathy rats induced by streptozotocin[J]. Am J Physiol Renal Physiol,2011, 300(4): 947-956.

[8] 孫永寧, 馮雯, 劉忠. 糖尿病腎陰虛證模型大鼠血液標(biāo)本的代謝組學(xué)研究[J]. 山東中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào), 2010, 34(1): 80-82.

[9] Lei R, Wu C, Yang B, et al. Integrated metabolomic analysis of the nano-sized copper particle-induced hepatotoxicity and nephrotoxicity in rats: a rapid in vivo screening method for nanotoxicity[J]. Toxicol Appl Pharmacol, 2008, 232(2): 292-301.

[10]Hu YM, Pai MH, Yeh CL, et al. Glutamine administration ameliorates sepsis-induced kidney injury by downregulating the high-mobility group box protein-1-mediated pathway in mice[J]. Am J Physiol Renal Physiol, 2012, 302(1): 150-158.

[11]Nowak A, Libudzisz Z. Influence of phenol, p-cresol and indole on growth and survival of intestinal lactic acid bacteria[J]. Anaerobe, 2006, 12(2): 80-84.

[12] 尤麗, 巴吐?tīng)枴べI買提明, 哈木拉提·吾甫爾. 基于核磁共振的腎虛痰瘀型2型糖尿病患者血清代謝組學(xué)研究[J].科技導(dǎo)報(bào), 2012, 30(8): 25-29.

[13]Sun YJ, Wang HP, Liang YJ, et al. An NMR-based metabonomic investigation of the subacute effects of melamine in rats[J]. J Proteome Res, 2012, 11(4): 2544-2550.

[14]Kwan BC, Kronenberg F, Beddhu S, et al. Lipoprotein metabolism and lipid management in chronic kidney disease[J].J Am Soc Nephrol, 2007, 18(4): 1246-1261.

[15]Zhao X, Dey A, Romanko OP, et al. Decreased epoxygenase and increased epoxide hydrolase expression in the mesenteric artery of obese Zucker rats[J]. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol, 2005, 288(1): 188-196.