染色體數(shù)目眾多的植物玻片制片技術(shù)

摘要：探究體積較小且數(shù)目眾多的植物染色體制片方法，摸索一套適合這類植物的制片方法，為這一類植物的染色體鑒定提供資料。

關(guān)鍵詞：染色體；制片；技術(shù)

中圖分類號：Q943-3 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：1674-0432（2012）-12-0031-1

目前，針對部分染色體數(shù)目眾多、體積太小或染色體過于細(xì)長，容易纏繞的植物，其玻片制作仍然存在著較大的難度，國外在這方面也早有研究[1]。本文以楊柳科楊屬的滇楊（Populus yunnanensis Dode）[2]作為例子簡介這一類植物的制片方法。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗材料為西南林業(yè)大學(xué)校園內(nèi)生長健壯，無病蟲害的成年大樹的兩年生滇楊枝條，剪取后置于水桶中于室溫下水培。

1.2 方法

參考李懋學(xué)[3，4]，李國珍[5]，康向陽[6，7]等在文中所提到的實驗方法，結(jié)合改良后的部分操作步驟進(jìn)行制片。實驗前將從室外采集的枝條下半部約10cm高的部位浸入水中培養(yǎng)，待其根長約1～1.5cm時，選取生長良好、粗壯的根，截取整個根部置于裝滿蒸餾水的培養(yǎng)皿中待用。

1.2.1 預(yù)處理 分別用0.2%秋水仙素、對二氯苯飽和水溶液、0.002mol/L 8-羥基喹啉、8-羥基喹啉0.002mol/L+秋水仙素0.2%、8-羥基喹啉0.002mol/L+對二氯苯飽和以及低溫4°24h作為預(yù)處理組合，分別對滇楊根尖處理1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0 h ，從而確定最佳預(yù)處理的藥劑和時間的組合。

1.2.2 固定 將經(jīng)過預(yù)處理后的材料轉(zhuǎn)入固定液中進(jìn)行固定，固定液組合為（Ⅰ：冰乙酸：無水乙醇為1：2；Ⅱ：冰乙酸：無水乙醇為1：3） 于冰水混合物、4℃以及常溫中固定1.0、2.0、4.0、20.0、24.0h ， 從而確定最佳的固定藥劑和固定溫度的組合。

1.2.3 解離 將上一步驟中經(jīng)過固定的材料，利用HCL和酒精混合的解離液進(jìn)行解離（組合Ⅰ：1mol/L鹽酸：無水乙醇=1：1；組合Ⅱ：濃鹽酸：無水乙醇=1：1），于常溫、40℃±1℃、60℃±1℃中進(jìn)行解離，以期獲得最佳的解離時間及溫度的組合。

1.2.4 染色及壓片 從根尖部位起截取約1mm左右長度的根，置于潔凈的載玻片上，用鑷子稍做按壓鋪平，滴加一滴堿性改良卡寶品紅染液包埋材料靜置，之后洗凈材料上的染液，蓋上蓋玻片后進(jìn)行常規(guī)壓片。

1.2.5 封片保存 將效果良好的玻片置于-20℃的冰箱中冷凍24h，之后取出在玻片解凍之前撬開蓋玻片和載玻片，在自然狀態(tài)下干燥后浸入叔丁醇中進(jìn)行透明處理15min左右，自然風(fēng)干后用中性樹膠進(jìn)行封片。

2 結(jié)果與分析

2.1 預(yù)處理

經(jīng)過上述試驗得出，對二氯苯飽和水溶液于冰水混合物中處理材料1.0h可以獲得良好的制片效果，能夠得到較多的形態(tài)清晰、收縮較好的中期分裂相細(xì)胞。綜合三個處理溫度來看，在冰水混合物條件下預(yù)處理材料時，總體效果優(yōu)于在常溫和4℃時。

2.2 固定

實驗表明在冰水混合物條件下，染色體的總體形狀較好，優(yōu)于常溫和4℃條件下，由此得出，低溫條件有利于染色體的沉淀和保持固定形狀。

2.3 解離

實驗表明利用組合Ⅱ（濃鹽酸：無水乙醇=1：1）于常溫下解離18min可以獲得良好的解離效果。且常溫下解離效果優(yōu)于40℃±1℃及60℃±1℃。

2.4 染色及制片

實驗表明利用改良堿性卡寶品紅染色9min可以獲得良好的染色效果，如圖1所示。

3 討論

（1）由于該材料取自水培苗，且是在室內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)，受溫度和光照等的影響較大，因此取材時最好在細(xì)胞分裂的高峰期，一般認(rèn)為在溫度較高時細(xì)胞分裂比較旺盛。（2）通常情況下，秋水仙素對紡錘絲的作用效果較強(qiáng)，但實際試驗過程中發(fā)現(xiàn)對二氯苯飽和水溶液的效果優(yōu)于秋水仙素，這可能與處理溫度，材料差異等有關(guān)。（3）固定液的組合Ⅰ（冰乙酸：無水乙醇=1：2）效果優(yōu)于組合Ⅱ（冰乙酸：無水乙醇=1：3），這與材料的染色體細(xì)小，數(shù)量眾多，需要不同配比的固定液等因素有關(guān)。（4）在解離過程中組合Ⅱ的效果優(yōu)于組合Ⅰ，說明濃鹽酸條件下植物細(xì)胞間的果膠質(zhì)更容易被溶解，這與滇楊細(xì)胞較小，且排列致密等因素有關(guān)，其深層原因有待進(jìn)一步研究。

參考文獻(xiàn)

[1] SAKAMOTO K，SHIMOMURA K.Analysis of the structure of sex chromosomesin a dioecious plant，Cannabis saliva L.[J].L.Plant Physio1，1997，114（Sl）：243.

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[3] 李懋學(xué)，張贊平.作物染色體及其研究技術(shù)[M].北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，1996.

[4] 李懋學(xué)，張學(xué)攵方.植物染色體研究技術(shù)[M].哈爾濱：東北林業(yè)大學(xué)出版社，1991.

[5] 李國珍.染色體及其研究方法[M].北京：科學(xué)出版社，1985.

[6] 康向陽，王君.楊樹多倍體誘導(dǎo)技術(shù)研究[M].北京：科學(xué)出版社，2010，1：3.

[7] 康向陽.楊樹染色體數(shù)目和形態(tài)觀察[J].甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，1996b，43（6）：67-70.

作者簡介：陳杰（1985-），男，西南林業(yè)大學(xué)2010級研究生，研究方向：林木遺傳育種。

網(wǎng)絡(luò)出版時間：2013-1-31 9：53：37

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