探討玉米自交系農(nóng)稈菌轉(zhuǎn)化體系及轉(zhuǎn)抗蟲(chóng)基因

摘要：玉米是我國(guó)重要的生產(chǎn)和生活作物，對(duì)國(guó)民經(jīng)濟(jì)影響極大，并且占有極其重要的地位。但由于玉米田受到螟蟲(chóng)的危害，致使玉米產(chǎn)量遭受重大損失，而轉(zhuǎn)基因玉米植株對(duì)抗螟蟲(chóng)玉米品種具有很大作用，玉米外源基因轉(zhuǎn)化常用基因槍法，并采用稈菌法彌補(bǔ)其缺點(diǎn)，通過(guò)分析愈傷的誘導(dǎo)、侵染條件、轉(zhuǎn)化后的篩選、再生、移栽等建立了完整高效的農(nóng)稈菌轉(zhuǎn)化體系，對(duì)農(nóng)業(yè)發(fā)展具有重要意義。

關(guān)鍵詞：玉米自交系；轉(zhuǎn)抗蟲(chóng)基因；稈菌法

中圖分類(lèi)號(hào)：S513文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A文章編號(hào)：1674-0432（2012）-07-0117-1

玉米蟲(chóng)害從來(lái)都是制約其高產(chǎn)、穩(wěn)產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)的重要因素。人類(lèi)在生產(chǎn)實(shí)踐中總結(jié)出好多防治蟲(chóng)害方法，我國(guó)蟲(chóng)害造成玉米減產(chǎn)12％，為減輕其危害，人們采用化學(xué)防治和生物防治方法，施用化學(xué)殺蟲(chóng)劑來(lái)控制農(nóng)業(yè)害蟲(chóng)成本高，并且由于害蟲(chóng)的自適應(yīng)性使害蟲(chóng)逐步產(chǎn)生抗性，并使化學(xué)藥劑在食物中的殘留，使人類(lèi)健康受到嚴(yán)重危害；另外，由于化學(xué)殺蟲(chóng)劑的非特異性，使害蟲(chóng)的天敵也受到傷害，引起多種生物資源失衡，破壞了自然界的生態(tài)平衡；生物防治包括生物殺蟲(chóng)劑的開(kāi)發(fā)和使用、生態(tài)防治、常規(guī)的抗蟲(chóng)育種，它是防治玉米病蟲(chóng)害的一項(xiàng)重要手段，可是它所起的作用只是避免害蟲(chóng)不發(fā)生成災(zāi)，利用各種途徑來(lái)獲得抗蟲(chóng)作物品種范疇也小。產(chǎn)生這種現(xiàn)象的原因是新品種選育周期長(zhǎng)，抗蟲(chóng)性狀的遺傳背景復(fù)雜，不能輕易使用材料來(lái)作為雜交育種的親本，因此導(dǎo)致害蟲(chóng)新生物型的發(fā)展導(dǎo)致抗性不均衡。

基因工程手段選育抗蟲(chóng)品種的優(yōu)越性在于這種手段能夠打破種屬界限，通過(guò)現(xiàn)有的植物、動(dòng)物、微生物中的多種豐富抗性基因，抗性的特點(diǎn)在于連續(xù)性和整體性，控制發(fā)生的蟲(chóng)害時(shí)間長(zhǎng)，位置不限，并且玉米的育種周期短，從早期就能夠?qū)ζ漕A(yù)見(jiàn)性，所用的投資少，見(jiàn)效快，并且在使用過(guò)程中不污染環(huán)境，因此也相應(yīng)地對(duì)生態(tài)環(huán)境有間接的保護(hù)作用，其抗蟲(chóng)性不易被外界環(huán)境因素破壞。

1 玉米抗蟲(chóng)基因工程現(xiàn)狀

植物抗蟲(chóng)基因工程關(guān)鍵是獲得抗蟲(chóng)基因，我們經(jīng)常使用的抗蟲(chóng)基因特點(diǎn)和它們的應(yīng)用包括以下幾個(gè)方面：

1.1 微生物來(lái)源的抗蟲(chóng)基因

首先是Bt毒蛋白基因，Bt殺蟲(chóng)蛋白具有很高的殺蟲(chóng)活性，它對(duì)多個(gè)重要農(nóng)業(yè)害蟲(chóng)具有高特異殺蟲(chóng)活性，其中蘇云金稈菌是一種革蘭氏陽(yáng)性土壤稈菌，殺蟲(chóng)蛋白通常被稱(chēng)為殺蟲(chóng)晶體蛋白，殺蟲(chóng)晶體蛋白的作用機(jī)制是一個(gè)非常復(fù)雜的問(wèn)題，對(duì)人畜和非標(biāo)靶昆蟲(chóng)非常安全，在昆蟲(chóng)消化道內(nèi)消化酶作用下，一定程度上可防止殺蟲(chóng)蛋白在環(huán)境中降解，殺蟲(chóng)效果明顯。因此，被廣泛用于防治重要的農(nóng)業(yè)害蟲(chóng)；其次是營(yíng)養(yǎng)殺蟲(chóng)蛋白基因。這是由于Bt殺蟲(chóng)蛋白對(duì)某些農(nóng)業(yè)上重要害蟲(chóng)的作用不明顯，如小地老虎，而蘇云金芽孢稈菌芽孢形成前的營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)階段分泌的殺蟲(chóng)營(yíng)養(yǎng)蛋白，Vip蛋白對(duì)小地老虎、粘蟲(chóng)和甜菜葉蛾有特效；在研究中發(fā)現(xiàn)，膽固醇氧化酶基因也表達(dá)的產(chǎn)物是一類(lèi)新型殺蟲(chóng)劑，對(duì)玉米蟲(chóng)害有明顯的防治效果，它能夠使攝食昆蟲(chóng)的腸道表皮細(xì)胞出現(xiàn)胞溶現(xiàn)象，從而使玉米害蟲(chóng)死亡。

1.2 植物來(lái)源的抗蟲(chóng)基因

在植物中發(fā)現(xiàn)有四類(lèi)蛋白酶抑制劑，這些蛋白酶抑制劑抗蟲(chóng)基因存在于所有生命體中。一般有豇豆胰蛋白酶抑制劑、大豆Kunitz型胰蛋白酶抑制劑、水稻中發(fā)現(xiàn)兩種巰基蛋白酶抑制劑，馬鈴薯蛋白酶抑制劑可調(diào)控基因使其在蟲(chóng)害時(shí)進(jìn)行表達(dá)；幾丁質(zhì)酶存在于植物和微生物中，與其他抗蟲(chóng)基因產(chǎn)物共同作用可以提高抗蟲(chóng)效果；淀粉酶抑制劑在植物中普遍存在，抑制昆蟲(chóng)消化道內(nèi)淀粉酶的活性，抵御外來(lái)病蟲(chóng)害的侵襲發(fā)揮著重要的作用；核糖體失活蛋白基因廣泛存在于高等植物中。通過(guò)中樞神經(jīng)系統(tǒng)使昆蟲(chóng)產(chǎn)生厭食反應(yīng)，促使核糖體失括，抑制細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的合成；植物外源凝集素基因，具有保護(hù)植物免受害蟲(chóng)侵害的作用。另外，還有許多其他植物來(lái)源的抗蟲(chóng)基因。如非蛋白殺蟲(chóng)物質(zhì)，煙草陰離子過(guò)氧化酶等。

1.3 動(dòng)物來(lái)源的抗蟲(chóng)基因

蝎昆蟲(chóng)毒素基因，可開(kāi)發(fā)作為一種高效生物殺蟲(chóng)劑。對(duì)玉米害蟲(chóng)具有極強(qiáng)的致死性，可以極大地減少害蟲(chóng)對(duì)玉米的取食；蜘蛛毒素基因。一種蜘蛛毒液中分離純化到一種小肽能殺死多種對(duì)農(nóng)作物有害的昆蟲(chóng)。

2 農(nóng)稈菌轉(zhuǎn)化受體系統(tǒng)建立

建立良好的受體系統(tǒng)是玉米基因工程的一個(gè)關(guān)鍵環(huán)節(jié)，原生質(zhì)體是最早應(yīng)用成功的玉米遺傳轉(zhuǎn)化受體材料，鑒于原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化受體系統(tǒng)的諸多不足，提高玉米轉(zhuǎn)化細(xì)胞的再生能力是受體系統(tǒng)建立的關(guān)鍵。

現(xiàn)在，關(guān)于玉米基因?qū)敕椒ㄒ话惆ɑ驑尫?、農(nóng)稈菌介導(dǎo)法、PEG法和電擊法，根癌農(nóng)稈菌屬革蘭氏陰性菌，被成功地應(yīng)用于玉米、小麥等重要的農(nóng)作物上。

農(nóng)稈菌介導(dǎo)法的優(yōu)點(diǎn)是操作簡(jiǎn)單，能導(dǎo)入大片段DNA，機(jī)理較為清楚。其轉(zhuǎn)化效率受以下因素影響：基因型是影響農(nóng)稈菌轉(zhuǎn)化效率的一個(gè)重要因素，細(xì)菌菌株和載體質(zhì)粒的構(gòu)建常用的載體是PSBl31和PTOK233，不同來(lái)源的受體，其對(duì)農(nóng)稈菌的敏感性也不同，農(nóng)稈菌轉(zhuǎn)化玉米需要進(jìn)行一定時(shí)間的共培養(yǎng)。另外，培養(yǎng)溫度、菌的培養(yǎng)方式、培養(yǎng)基類(lèi)型也會(huì)影響其轉(zhuǎn)化效率。

基因槍法?；驑尫ㄟ€可用于細(xì)胞器的轉(zhuǎn)化，是一種遺傳物質(zhì)直接導(dǎo)入技術(shù)。這種技術(shù)在玉米遺傳轉(zhuǎn)化中獲得了廣泛應(yīng)用并取得了很好的效果。主要缺點(diǎn)是外源DNA整合機(jī)理不清楚。

電擊法。借助高壓脈沖電場(chǎng)擊破轉(zhuǎn)化受體的細(xì)胞膜，優(yōu)點(diǎn)是簡(jiǎn)單，快速，費(fèi)用較低，設(shè)備簡(jiǎn)單。

PEG即聚乙二醇，是一種高分子多聚物，PEG法轉(zhuǎn)化植物原生質(zhì)體成本低廉，初是用作原生質(zhì)體的融合劑。結(jié)果較為穩(wěn)定，重復(fù)性較好，外源基因直接轉(zhuǎn)化植物原生質(zhì)體的誘導(dǎo)劑。特別是不需要特殊的儀器設(shè)備，易于推廣。

3 玉米抗蟲(chóng)基因工程存在的問(wèn)題及應(yīng)對(duì)策略

昆蟲(chóng)對(duì)轉(zhuǎn)基因植株產(chǎn)生抗性是一個(gè)嚴(yán)重問(wèn)題，可以拓寬轉(zhuǎn)基因植物的抗蟲(chóng)譜來(lái)解決，還可以利用其他的策略來(lái)減緩昆蟲(chóng)產(chǎn)生抗性，如采用輪作的方法。

源基因在轉(zhuǎn)基因植株中表達(dá)量低，可以選擇適合的基因表達(dá)調(diào)控元件，對(duì)殺蟲(chóng)蛋白基因一級(jí)結(jié)構(gòu)的改造，葉綠體轉(zhuǎn)化，利用核基質(zhì)結(jié)合區(qū)提高基因表達(dá)，建立位點(diǎn)特異性重組體系等方法進(jìn)行解決。

外源基因在轉(zhuǎn)化植株中不能穩(wěn)定表達(dá)，引起外源基因失活原因包括DNA甲基化、重復(fù)序列的存在、表達(dá)結(jié)構(gòu)之聞具有的同源性，共抑制的發(fā)生。解決的方法是在進(jìn)行外源基因的轉(zhuǎn)化時(shí)要對(duì)其進(jìn)行改造和修飾，避免多外源基因以多拷貝形式整合到植物基因組，避免成用相同的啟動(dòng)子和終止子，可以采用定點(diǎn)插入的方法破壞內(nèi)源基因的表達(dá)。

參考文獻(xiàn)

[1] Brettschneider R et at．1997．Theor Appl Genet，94：737-748．