大鼠肝臟中丙烯酰胺代謝的初步研究

摘要：丙烯酰胺（acrylamide，Acr）具有神經毒性、遺傳毒性和潛在的致癌性，食品中丙烯酰胺的存在及食用安全性引起了國際社會的高度重視。試驗選用Sprague—Dawley雄性大鼠80只，體重180-230g，鼠齡50d，隨機分成4組進行Acr染毒實驗，染毒劑量分別為0、25、50、100 mg／Kg，即對照組和低、中、高3個劑量組。對照組使用生理鹽水，染毒采用腹腔注射，隔日染毒，連續(xù)12周。分別在第3、6、9、12周末次染毒4 h后處死取樣。RT-PCR進行肝臟P4502E1mRNA的表達分析，來觀察Acr對大鼠肝臟P4502E1的活力及表達的影響。得出以下結果：大鼠肝細胞中P4502E1mRNA的表達，在染毒第12周以50mg/Kg劑量組表達量最高，25mg/Kg、100mg/Kg劑量組在第6周mRNA表達表現(xiàn)出峰值。本實驗研究丙烯酰胺肝臟代謝特點及P4502E1mRNA在肝臟丙烯酰胺代謝過程中的變化，為進一步探討丙烯酰胺代謝途徑及其毒性作用奠定了基礎。

關鍵詞：丙烯酰胺；環(huán)丙氧酰胺；細胞色素P4502E1

中圖分類號：R363文獻標識碼：A文章編號：1674-0432（2012）-07-0049-2

0 前言

環(huán)境中存在的丙烯酰胺均是人為引入，其主要來自于污水處理，尤其是塑料業(yè)可釋放大量的丙烯酰胺。當丙烯酰胺進入人體，可在人體內有蓄積作用，達到一定的蓄積量，就能夠導致周圍神經病變和小腦功能性障礙，并且與腎上腺癌、甲狀腺癌、乳腺癌和生殖系統(tǒng)癌癥的發(fā)病率存在一定的劑量暴露關系。因此，1994年，國際癌癥研究機構(International Agency for Research on Cancer，IARC)已經將其列為人類的可能致癌物質。由于丙烯酰胺具有潛在的神經毒性、遺傳毒性和致癌性，其暴露范圍已經擴大。因此，食品中丙烯酰胺的存在引起了國際社會的高度重視。為此，2002年6月25日世界衛(wèi)生組織(WHO)和聯(lián)合國糧農組織(FAO)召開了食品中丙烯酰胺問題專家咨詢會議，對食品中丙烯酰胺的食用安全性進行了探討。經動物實驗確認丙烯酰胺是一種致癌物。在對小鼠細胞進行的體內和體外培養(yǎng)中發(fā)現(xiàn)丙烯酰胺會破壞小鼠的遺傳物質DNA和RNA。但是對職業(yè)暴露人群進行調查，暴露于丙烯酰胺環(huán)境中的人因患癌癥死亡的比例相對于普通人群并無明顯增加。因此，丙烯酰胺在人體中的致癌性還存在一定的爭議。

1 試驗材料

Sprague—Dawley雄性大鼠80只，體重為180-230g，鼠齡50 d，由中英合資上海SIPPR/BK公司供應，清潔級。

將80只大鼠隨機分成4組，即對照組和低、中、高3個劑量組，首先進行適應性飼養(yǎng)l周后開始染毒。以腹腔注射的方法，染毒劑量分別為0、25、50、100mg／Kg。染毒時按等體積不同濃度用蒸餾水配成Acr稀釋液。對照組給予等體積的生理鹽水。隔日染毒，連續(xù)12周。

分別在實驗3、6、9周的末次染毒4h后，各組隨機抽取4只大鼠，腹腔注射氯胺酮麻醉大鼠，并立即取出肝臟，使用預冷的生理鹽水沖洗，濾紙吸干后，迅速切成小塊立即置于液氮罐中，-70℃保存?zhèn)溆?。對照組大鼠斷頭處死，在無菌條件下取肝臟，置于預先以氧飽和的冰KH(Krebs Henseleit，克雷伯-享斯雷特循環(huán))緩沖液中。

2 方法

2.1 總RNA的提取

將稱取好的肝臟提取總RNA，溶于DEPC水，-70℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 總RNA的純度及濃度的測定

提取的總RNA進行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，分光光度計測RNA含量。

2.3 P4502E1逆轉錄

設計P4502E1mRNA引物及內參，逆轉錄聚合酶鏈式反應(RT-PCR)按試劑盒說明進行操作。

P4502E1擴增：擴增產物410bp，上游引物5ˊ-CTCCTCGTCATATCCATCTG-3ˊ；下游引物5ˊ-ATTACCCTGTTTCCCCATTCC-3ˊ。

選擇β－肌動蛋白（β-actin）為內參，（擴增產物194bp）。上游引物5ˊ-TGACGTTGACATCCGTAAAG-3ˊ；下游引物5ˊ-ACAGTGAGGCCAGGATAGAG-3ˊ。

以上引物均由Primer Premier 5 軟件設計，并由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。結果用Quantity One? 1-D分析軟件進行圖像分析，用P4502E1與β-actin擴增條帶的比值表示P4502E1 mRNA表達的相對水平。

3 統(tǒng)計學處理

數(shù)據(jù)在Excel中建立數(shù)據(jù)庫，應用SPSS10.0統(tǒng)計分析軟件進行方差分析及多重比較。

4 結果與分析

4.1 肝微粒體P4502E1 mRNA表達

P4502E1mRNA表達測定結果：從表1、圖1可見，同一時間不同劑量組的比較發(fā)現(xiàn)，隨劑量的增加P4502E1mRNA相對表達量也增加。25、100mg/Kg劑量組在第6周mRNA表達表現(xiàn)出峰值，差異極顯著(P＜0.01)，隨后P4502E1mRNA表達呈現(xiàn)下降趨勢。在染毒第12周以50 mg/Kg劑量組表達量最高，差異極顯著(P＜0.01)（見圖2）。

注：1.同列小寫字母b表示差異顯著（P＜O.05），大寫字母B表示差異極顯著（P＜O.01）。

2.a表示同行數(shù)據(jù)比較差異不顯著，c表示同行數(shù)據(jù)比較差異顯著（P＜O.05），A表示差異極顯著（P＜O.01）。

4 討論

丙烯酰胺研究的試驗動物模型比較廣泛，包括哺乳動物、禽類和水生動物等，在細菌和線蟲內也有研究。其中運用最多的是大小鼠，又以大鼠與人體的丙烯酰胺代謝情況比較接近。本試驗以腹腔注射的方法染毒，Acr染毒劑量分別為0、25、50、100 mg／Kg。對照組給予等體積的生理鹽水，隔日染毒，連續(xù)12周。在第12周末未發(fā)現(xiàn)導致大鼠出現(xiàn)感覺－運動型周圍神經和中樞神經病變，說明在時間、劑量的設計上還存在問題，還不足以產生中毒癥狀。本實驗的大鼠未出現(xiàn)中毒癥狀，可能是由于品系的關系，但不影響對其進行病理研究。

P4502E1是一種參與體內生理、病理和毒理過程，并具有廣泛功能的代謝酶，其表達水平與代謝活性相關并且受體內外諸多因素的影響。P4502E1 mRNA表達實驗中，同一時間不同劑量組的比較發(fā)現(xiàn)，隨劑量的增加P4502E1mRNA相對表達量也增加，但在第12周以50mg/Kg劑量組活力最高，差異顯著(P＜0.05)。25mg/Kg和100mg/Kg劑量組在第6周mRNA表達表現(xiàn)出峰值。從P4502E1酶活力和mRNA表達結果都發(fā)現(xiàn)，在染毒第6周P4502E1酶活力和mRNA表達都出現(xiàn)峰值現(xiàn)象。雖然在染毒劑量上有差別（P4502E1酶活力表現(xiàn)在50mg/Kg和100mg/Kg劑量組，P4502E1 mRNA表達表現(xiàn)在25mg/Kg和100mg/Kg劑量組），但是給我們提示，Acr在肝臟中的代謝，在第6周時間段可達到最高值后，隨后將有向其他代謝轉變的可能。該結果為我們后續(xù)丙烯酰胺代謝特點、毒性研究中關于時間和劑量的設計和試驗上提供了依據(jù)。

參考文獻

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作者簡介：張海明（1982-），男，山西農業(yè)大學信息學院，助教。