心痛舒含藥血清預處理對乳鼠心肌細胞缺氧/復氧損傷及TNF-α、IL-1β的影響

任 婷 ，黃政德 *，田雪飛，陳楚淘

（1.湖南中醫(yī)藥大學醫(yī)學院，湖南 長沙 410208；2.湖南中醫(yī)藥大學第一中醫(yī)臨床學院，湖南 長沙 410007；3.湖南中醫(yī)藥大學中西醫(yī)結(jié)合學院，湖南 長沙 410208；4.湖南中醫(yī)藥大學研究生處，湖南 長沙 410208）

心痛舒含藥血清預處理對乳鼠心肌細胞缺氧/復氧損傷及TNF-α、IL-1β的影響

任 婷1，黃政德2*，田雪飛3，陳楚淘4

（1.湖南中醫(yī)藥大學醫(yī)學院，湖南 長沙 410208；2.湖南中醫(yī)藥大學第一中醫(yī)臨床學院，湖南 長沙 410007；3.湖南中醫(yī)藥大學中西醫(yī)結(jié)合學院，湖南 長沙 410208；4.湖南中醫(yī)藥大學研究生處，湖南 長沙 410208）

目的 觀察心痛舒含藥血清預處理對缺氧/復氧乳鼠心肌細胞核因子-κBp65（NF-κBp65）及其下游調(diào)控因子腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白介素-1β（IL-1β）的影響，探討心痛舒對心肌細胞缺氧/復氧損傷的保護作用機制。方法 原代培養(yǎng)SD乳鼠心肌細胞，建立模擬心肌細胞缺氧／復氧損傷模型，設(shè)正常組、模型組、陽性對照組、心痛舒含藥血清預處理組共4組。羅丹明B染色法觀察心肌細胞形態(tài)，ELISA法測定培養(yǎng)液上清TNF-α、IL-1β含量，半定量RT-PCR方法檢測NF-κBp65 mRNA表達水平。結(jié)果 與模型組比較，陽性對照組、心痛舒含藥血清預處理組TNF-α、IL-1β水平降低，NF-κBp65 mRNA的表達水平下降，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）；與陽性對照組比較心痛舒含藥血清預處理組NF-κBp65 mRNA表達降低，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。結(jié)論 心痛舒含藥血清預處理可通過抑制缺氧-復氧心肌細胞炎癥反應途徑發(fā)揮保護作用，其機制與抑制NF-κB活化，從而抑制下游炎性細胞合成有關(guān)。

心痛舒；心肌細胞；炎癥因子；心肌細胞核因子-κBp65；腫瘤壞死因子-α；白介素-1β；乳鼠；作用機制

心肌細胞發(fā)生缺血再灌注損傷過程中，炎性介質(zhì)的過表達是造成心肌炎癥反應的重要原因[1]，上游調(diào)控如核因子（NF-κB)的激活是誘導炎癥反應發(fā)生的重要途徑[2]。前期研究發(fā)現(xiàn)，心痛舒預處理對防治心肌缺血再灌注損傷（Ischemia/reperfusion injury，IRI）具有重要作用[3-6]，而且可調(diào)節(jié)心肌細胞核因子（NF-κBp65）的表達水平。我們推測，心痛舒可能通過抑制NF-κB激活，使下游的炎癥因子下調(diào)，從而抑制炎癥反應，發(fā)揮抗心肌IRI保護作用。為此，本研究用血清藥理學方法，采用培養(yǎng)乳鼠心肌細胞模擬缺氧／復氧損傷模型，進一步研究心痛舒含藥血清預處理對心肌細胞缺氧/復氧損傷后NF-κB表達及其下游炎癥因子的影響，從炎癥反應調(diào)控角度深入探討心痛舒抗心肌缺血再灌注損傷的保護作用機制。

1 材料與方法

1.1 藥物與動物

（1）心痛舒(由丹參 20 g，檀香 6 g，赤芍 10 g，川芎 6 g，當歸 6 g，紅花 6 g，生地黃 12 g組成)，中藥材購自湖南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院中藥房，浸泡，水煎2次（檀香后下），藥液經(jīng)1000 r/min離心10min去除雜質(zhì)，濃縮為含生藥量2 g/mL。（2）SPF級12～24 h齡SD乳鼠20只，湖南中醫(yī)藥大學實驗動物中心提供 （許可證號：SCXK湘2009-0004）。

1.2 試劑與儀器

DMEM、PBS和胰蛋白酶（Gibco公司，美國）；特級胎牛血清（Hyclone公司，中國）；羅丹明B（北京索來寶科技有限公司，中國）；RT-PCR試劑盒（Takara生物公司，中國）；腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白介素-1β（IL-1β）定量ELISA試劑盒（博士德生物工程公司，中國）；超高速冷凍離心機（HERMLE公司，德國）；凝膠圖像處理系統(tǒng)（UVI公司，美國）；紫外可見光分光光度計UV-754型（上海第三分析儀器廠，中國）；圖像分析儀（Bio-Rad公司，美國）；熒光顯微鏡（Olympus公司，日本）。

1.3 SD乳鼠心肌細胞原代培養(yǎng)及鑒定

無菌切取SD乳鼠心室肌，4℃的PBS液中漂洗后加入1 mL的0.08%胰蛋白酶，于37℃恒溫水浴箱中消化后去除上清液，再加入1 mL混合酶（0.06%胰蛋白酶+0.08%I型膠原酶）消化5min離心棄上清液后，采用離心差速貼壁法分離成纖維細胞和心肌細胞，將貼壁的心肌細胞以1.5×105/mL接種于6孔板，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；將部分未貼壁的細胞以1×104/孔接種于96孔板內(nèi)，進行噻唑藍（MTT）實驗，確定最佳工作濃度。48 h后進行細胞換液，觀察心肌細胞搏動并采用免疫組化法檢測心肌特異性肌鈣蛋白T(cTnT)，進行心肌細胞觀察與鑒定。

1.4 心痛舒含藥血清制備及其對心肌細胞的細胞毒性檢測

參照 《藥理實驗方法學-新技術(shù)與新方法》[7]258中藥物血清的制備方法。 取SD大鼠20只，雌雄各半，依據(jù)臨床常用量按實驗動物與人體表面積折算的等效劑量比值換算[7]258，利用mg/kg折算mg/m2轉(zhuǎn)換因子進行計算，大鼠每只用量為：6.42 g/（kg·d）灌胃，每天2次，連續(xù)3 d；空白組予等量生理鹽水灌胃。末次給藥1 h后頸總動脈取血，分離血清，滅活后-20℃保存?zhèn)溆?。噻唑藍（MTT）比色法檢測含藥血清對乳鼠心肌細胞活力的影響，以對心肌細胞抑制率最小的含藥血清濃度作為下一步實驗的工作濃度。

1.5 心肌細胞H/R模型建立

參照 《藥理實驗方法學》[8]進行。配制低糖DMEM培養(yǎng)基，加入青鏈霉素雙抗，不加血清；將培養(yǎng)基用高純氮氣充分飽和30min，流量為1 L/min，使培養(yǎng)液氧分壓降至4 KPa；將上述飽和后的培養(yǎng)基快速置換細胞培養(yǎng)瓶內(nèi)的原培養(yǎng)基；將細胞培養(yǎng)瓶置入塑料袋內(nèi)，充滿氮氣，37℃密閉；1 h后收集上清液，將培養(yǎng)基換為DMEM培養(yǎng)基，加新培養(yǎng)液，復氧2 h，收集上清液。

1.6 分組與處理

隨機分為4組。正常組：在完全培養(yǎng)基中加入10%大鼠正常血清，連續(xù)常規(guī)培養(yǎng)24 h；模型組：缺氧1 h，復氧2 h；陽性對照組：培養(yǎng)液中加入50mg/L的心腦舒通膠囊 （吉林敖東制藥，批號：20100207，15mg）（GSTT）后予缺氧 1 h，復氧 2 h；心痛舒含藥血清預處理組（心痛舒組）：培養(yǎng)液中加入10%心痛舒含藥血清后予缺氧1 h，復氧2 h。MTT檢測時按藥物血清梯度濃度分7組，檢測后選擇了10%濃度組為下一步實驗濃度。

1.7 觀察指標

1.7.1 羅丹明染色法觀察心肌細胞形態(tài) 羅丹明B染色后在倒置顯微鏡下觀察各組心肌細胞形態(tài)學變化并攝像（觀察其搏動、形狀、折光率等）。羅丹明染色步驟：用DMSO配制1mg/mL的羅丹明B液；將96孔板內(nèi)的培液吸出，用PBS清洗；每孔加入200 μL的 PBS， 再加入 4 μL的羅丹明 B液；573 nm熒光下激發(fā)3min，然后拍照。

1.7.2 ELISA法檢測 TNF-α、IL-1β的含量 取培養(yǎng)上清液以ELISA法檢測炎癥因子TNF-α、IL-1β含量。具體步驟如下：用包被緩沖液稀釋包被抗原至最適濃度（5～20 μg/mL）各 0.3 mL 加于微反應板每個凹孔中，37℃水浴2～3 h，4℃貯存；移去包被液，凹孔用洗滌緩沖液（含0.05%吐溫-20）洗滌；每凹孔加入用稀釋緩沖液稀釋的受檢上清液各0.2 mL，37 ℃，作用 1～2 h；洗滌；加入酶結(jié)合物辣根過氧化物酶羊抗兔IgG：每凹孔加入稀釋緩沖液稀釋的酶結(jié)合物0.2 μL。37℃作用1～2 h；洗滌；加入鄰苯二胺溶液0.2 μL底物溶液于每個凹孔，室溫作用 30min；每凹孔加 2M H2SO40.05 μL；用酶聯(lián)免疫檢測儀記錄490 nm處測量各孔A值。

1.7.3 RT-PCR法檢測NF-κBp65 mRNA表達水平RT-PCR按說明書操作。NF-κBp65 mRNA引物（上海生物工程技術(shù)服務公司，中國），設(shè)計參考文獻[9]。

上游引物：5'-AAGATCAATGGCTACACAGG-3'，下游引物：5'-CCTCAATGTCTTCTTTCTGC-3'（GI:M61909，產(chǎn)物長度493bp，Tm：55.75℃ ）β -actin， 正義鏈：5'-GTAGCCATCCAGGCTGTCTT-3'，反義鏈：5'-CAGTGAGGCCAGGATAGAGAC-3'，（GI:NM031144，產(chǎn)物長度 648bp，Tm:56.5℃）。

PCR產(chǎn)物相對量=PCR產(chǎn)物電泳條帶面積積分吸光度/β-actin電泳條帶面積積分吸光度。用美國BioRad公司Quantity One V4.5軟件分析。

1.8 統(tǒng)計學分析

采用SPSS 13.0軟件進行統(tǒng)計分析，數(shù)值變量資料以“”表示，采用單因素方差分析，以 P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 免疫組化鑒定心肌細胞及含藥血清工作濃度的確定

倒置顯微鏡下觀察見心肌細胞通過偽足細胞相互交織成網(wǎng)，漸形成細胞簇，搏動規(guī)則、有力（圖1①）；免疫組化染色鑒定結(jié)果顯示心肌細胞呈強陽性（圖1②），純度可達95%以上；陰性對照組呈陰性（圖 1③）。

用MTT比色法檢測乳鼠心肌細胞活力，結(jié)果顯示，當藥物血清濃度在低于10%時無細胞毒性，在15%以上時有細胞毒性，故取無細胞毒性的10%濃度，見表1。

表1 心痛舒對心肌細胞的毒性測定結(jié)果 （，n=5）

表1 心痛舒對心肌細胞的毒性測定結(jié)果 （，n=5）

注：與細胞對照組比較△P＜0.05，△△P＜0.01。

藥物終濃度（%）2520151052.5細胞對照組抑制率（%）71.1665.9838.99-1.08-2.09-1.49—A 值（L/cg·cm）0.1583±0.0498△△0.1733±0.0547△△0.2625±0.1022△0.3981±0.08310.4020±0.00750.3997±0.00980.3938±0.1636

2.2 各組心肌細胞形態(tài)學觀察

正常組細胞形狀多樣化，呈圓形、梭型及錐型，胞漿突起呈枝芽狀，向細胞簇周圍呈放射狀生長，折光性強。缺氧復氧損傷后，胞體折光性下降，細胞形態(tài)極不規(guī)則，細胞變形，出現(xiàn)大量碎片。陽性對照組心肌細胞形狀較規(guī)則，細胞生長欠佳，碎片較多。心痛舒組心肌細胞形狀較規(guī)則，細胞生長尚可，碎片明顯較少，心肌細胞形態(tài)較缺氧/再復氧組明顯改善。見圖2。

2.3 各組TNF-α、IL-1β含量變化

與正常組比較，H／R組培養(yǎng)液上清TNF-α、IL-1β水平明顯升高，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）；與H／R組比較，陽性對照組、心痛舒組可明顯降低TNF-α、IL-1β（P＜0.01）。 陽性對照組與心痛舒組比較無統(tǒng)計學意義。見表2。

表2 心痛舒含藥血清預處理對乳鼠心肌細胞H/R損傷后 TNF-α、IL-1β 水平的影響（，n=8，ng/mL）

表2 心痛舒含藥血清預處理對乳鼠心肌細胞H/R損傷后 TNF-α、IL-1β 水平的影響（，n=8，ng/mL）

注：與正常組比較**P＜0.01；與模型組比較△△P＜0.01。

組 別正常組模型組陽性對照組心痛舒組TNF-α 2.85±0.493.55±0.88**3.20±0.50△△3.12±0.68△△IL-1β 12.52±6.2525.07±7.13**17.85±4.25△△15.41±3.59△△

2.4 各組NF-κBp65 mRNA表達的比較

與正常組比較，模型組NF-κBp65 mRNA表達增高，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)；與模型組比較，陽性對照組、心痛舒組NF-κBp65 mRNA表達降低，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)。心痛舒組與陽性對照組比較，NF-κBp65 mRNA 表達顯著降低(P＜0.05)。見表3，圖3。

表3 各組心肌細胞中NF-κBp65 mRNA表達 （，n=8）

表3 各組心肌細胞中NF-κBp65 mRNA表達 （，n=8）

注：與正常組比較 **P＜0.01；與模型組比較△△P＜0.01；與陽性對照組比較*P＜0.05。

組 別正常組模型組陽性對照組心痛舒組NF-κBp65/GAPDH 0.28±0.050.45±0.12**0.19±0.03△△0.15±0.03*△△

3 討論

中藥復方或有效成分可通過調(diào)節(jié)炎癥因子的表達，從而參與抑制IRI的炎性損傷過程。其中NF-κB是一種重要的炎性調(diào)節(jié)因子。研究發(fā)現(xiàn)[10]NF-κB作為一種轉(zhuǎn)錄因子，可調(diào)節(jié)多種炎癥相關(guān)蛋白基因的表達，參與MI/R的炎癥反應。TNF-α、IL-1β是重要的炎性細胞因子，TNF-α作用于心肌細胞和內(nèi)皮細胞，誘導產(chǎn)生細胞間黏附分子，促使中性粒細胞黏附而介導缺血/再灌注損傷[11]。IL-1β通過多種機制參與了缺血再灌注損傷過程[12]。缺血再灌注損傷中的氧化應激刺激可激活NF-κB，而活化的NF-κB又可導致諸多炎性介質(zhì)如TNF-α、IL-1β的過度表達。因此，影響NF-κB的活性則可在轉(zhuǎn)錄水平影響多種炎性介質(zhì)的轉(zhuǎn)錄，從而對組織的再灌注損傷產(chǎn)生影響。抑制NF-κB信號通路可能對于再灌注損傷具有潛在的治療價值[13]。心痛舒是課題組在大量臨床實踐的基礎(chǔ)上創(chuàng)立而成，是臨床防治缺血性心臟病的有效方劑，全方由丹參、檀香、赤芍、川芎、當歸、紅花、生地黃等組成，具有活血祛瘀、行氣止痛之功效。我們前期實驗研究顯示[14-20]心痛舒可通過誘導腺苷、降鈣素基因相關(guān)肽及一氧化氮合酶等內(nèi)源性觸發(fā)物質(zhì)的釋放增多，促進蛋白激酶C活性增強及影響NF-κB蛋白表達，對缺血再灌注損傷心肌有明顯的延遲保護作用，心痛舒預處理后，能顯著減少家兔缺血再灌注損傷心肌的缺血面積和梗死面積。因此推測，心痛舒可通過抑制炎癥因子TNF-α、IL-1β的上游調(diào)控NF-κB p65基因轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)并抑制炎癥反應，對缺氧復氧損傷心肌細胞起保護作用。

本研究采用體外培養(yǎng)心肌細胞，造成心肌細胞缺氧-復氧病理模型，模擬體內(nèi)缺血再灌注樣損傷，不僅避免了體內(nèi)神經(jīng)、體液等諸多因素的影響，而且也避免了整體動物模型的不穩(wěn)定性，加強了模型的均一性，較能準確地反應受試藥物對細胞模型的干預作用。本研究發(fā)現(xiàn)，正常培養(yǎng)條件下，心肌細胞培養(yǎng)基中 TNF-α、IL-1β水平均較低，H/R刺激使TNF-α、IL-1β含量均明顯增加，提示炎癥因子TNF-α、IL-1β是缺氧復氧損傷的重要因素，加重了心肌細胞功能障礙。心痛舒含藥血清預處理能抑制NF-κBp65活性，降低 NF-κB p65mRNA 表達，減少炎癥因子TNF-α、IL-1β生成，抑制炎癥反應，從而對缺氧復氧損傷心肌細胞起保護作用，這可能是心肌缺氧/復氧損傷耐受性產(chǎn)生的重要分子機制之一。本研究提示心痛舒可通過抑制NF-κB激活，使下游炎性細胞因子表達下調(diào)，從而抑制缺氧/復氧導致的心肌細胞炎性損傷。

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Effects of preconditioning with serum containing Xintongshu on the newborn rat's myocardial cells with hypoxia and reoxygenation injury and the expression of TNF-αand IL-1β

REN Ting1,HUANG Zheng-de2,TIAN Xue-fei3,CHEN Chu-tao4
（1.Medical College,TCM University of Hunan， Changsha， Hunan 410208,China；2.First TCM Clinical College,TCM University of Hunan， Changsha， Hunan 410007,China;3.College of Integrated Chinese and Western Medicine,TCM University of Hunan，Changsha，Hunan 410208,China;4.Postgraduate Department,TCM University of Hunan，Changsha，Hunan 410208,China）

Xintongshu;myocardial cell;inflammatory cytokines;NF-κB p65;TNF-α;IL-1β;newborn rat;mechanism of iaction

R285.5

A

10.3969/j.issn.1674－070X.2012.11.003.011.05

〔Absrract〕Objective To observe the regulating effects of preconditioning with serum containing Xintongshu on the expression of nuclear factor-κBp65(NF-κBp65),tumor necrosis factor-α(TNF-α)and interleukin-1β(IL-1β),and to explore the protective mechanism of Xintongshu on the hypoxia and reoxygen injury myocardial cell model of newborn rat. Methods The myocardial cells were isolated from neonatal rats and cultured,then modelled with hypoxia andreoxygenation injury.The modeled myocardial cells were randomly divided into four groups,including normal control group,model control group,positive control group and preconditioning group treated with serum containing Xintongshu (Xintongshu group).The myocardial cell morphologic changes were observed by Rhodamine B stain.The TNF-α and IL-1β proteinsin culture media were detected by ELISA and the mRNA expression level of NF-κBp65 was detected by RT-PCR.Results Compared with model control group，the expression levels of TNF-α and IL-1β proteins and NF-κBp65 mRNA in positive control group and Xingtongshu group were decreased.There were statistical differences （P＜0.01）.Compared with positive control group,the expression levels of NF-κBp65 mRNA in Xingtongshu group were statistically decreased （P＜0.05）.Conclusion The preconditioning with serum containing Xintongshu can exert a protective effect by inhibiting the inflammatory reaction pathway of the hypoxia and reoxygenation myocardial cells.The effect may be related to the decrease of the NF-κB p65 mRNA expression level and further inhibition of thegeneration of inflammatory cells.

2012－09－20

國家自然科學基金資助項目（30973750）；湖南省教育廳重點科研項目（09A071）；湖南省重點學科中醫(yī)內(nèi)科學資助項目。

任 婷（1983-），女，湖南湘潭人，碩士研究生，講師，主要從事心血管疾病的中醫(yī)藥防治研究。

* 黃政德，男，教授，博士研究生導師，E-mail：Hzd112@163.com。

（本文編輯 徐愛良）