鼠角膜緣干細胞3D 共培養(yǎng)模型的建立及生存率、表型維持

熊林杰， 鄭 恬， 胡義珍

華中科技大學同濟醫(yī)學院附屬協(xié)和醫(yī)院眼科，武漢 430022

外傷、化學燒傷、自身免疫性疾病等原因?qū)е碌慕悄ぞ壐杉毎狈腿笔浅Ｒ姸覈乐氐难郾砑膊?，角膜緣干細胞移植和重建是治療許多眼表疾病的重要甚至是唯一的選擇。移植和重建的效果很大程度上決定于角膜緣干細胞的植入方式、植入后存活率及其功能狀態(tài)［1－2］。因此，如何促進角膜緣干細胞的存活和功能是值得研究的一個課題。角膜緣干細胞在體內(nèi)生長的微環(huán)境是由各種不同的細胞和細胞外基質(zhì)蛋白構成的一個有機整體，它們在促進角膜緣干細胞的存活和增生中發(fā)揮著不同的作用［3－4］。本實驗中，我們用纖維蛋白模擬細胞外基質(zhì)蛋白，用鼠胚胎成纖維細胞模擬鼠角膜緣干細胞周圍的支持細胞，探討通過小鼠角膜緣干細胞和纖維蛋白以及胚胎成纖維細胞的共同培養(yǎng)是否有助于提高角膜緣干細胞的生存率和其表型的維持。

1 材料與方法

1.1 細胞培養(yǎng)及實驗分組

1.1.1 鼠角膜緣干細胞的獲取 采用顯微手術獲取10 只BALB／c小鼠（Charles River Laboratory）角膜緣，剪碎后胰酶消化10 min，300g 離心10 min，再將獲取的細胞用RPMI－1640 培養(yǎng)液混勻。細胞計數(shù)后，按1×105／孔的密度將細胞種在6 孔板。1周后轉(zhuǎn)移到10cm2的培養(yǎng)皿。將細胞培養(yǎng)于Celltrak培養(yǎng)板（Fisher Scientific）中，以兔抗鼠抗Integrinα9抗體（Santa Cruz）鑒定細胞表型。

1.1.2 鼠胚胎成纖維細胞的獲取 將懷孕13.5d的母鼠麻醉處死，剝離子宮，將胚胎洗凈后顯微鏡下剝離神經(jīng)和內(nèi)臟，保留軀干及四肢皮膚組織。使用刀片將其皮膚切碎，加入胰酶消化5～10min，培養(yǎng)液中和后1 000g離心5min，去上清后加新鮮培養(yǎng)液，培養(yǎng)到足夠數(shù)目后，將其暴露于伽馬射線1h以消除其分裂能力。

1.1.3 3D 細胞培養(yǎng)及實驗分組 鼠角膜緣干細胞單獨培養(yǎng)組（A 組）：將3×104角膜緣干細胞混合于300μL的培養(yǎng)液中，加入96 孔圓底培養(yǎng)板培養(yǎng)。鼠角膜緣干細胞與纖維蛋白共培養(yǎng)組（B 組）：將纖維蛋白原配成10mg／mL 的磷酸鹽溶液，與鼠角膜緣干細胞混合成3×105／mL的混合懸液，取100μL細胞懸液加入96孔圓底培養(yǎng)板，再加入3μL 的50 U／mL的凝血酶，5min后小心加入200μL 的細胞培養(yǎng)液。鼠角膜緣干細胞、纖維蛋白和鼠胚胎成纖維細胞共培養(yǎng)組（C 組）：將鼠角膜緣干細胞與鼠胚胎成纖維細胞以1∶0.5的比例混合，制成含有10 mg／mL纖維蛋白原的4.5×105／mL 混合懸液，取100μL 加入96孔圓底培養(yǎng)板后再補充200μL 的培養(yǎng)液。以3×104個角膜緣干細胞單獨培養(yǎng)（A組）作為對照組。

1.2 流式細胞儀檢測細胞凋亡率和存活率

細胞凋亡率和存活率采用Annexin Ⅴ－PE 凋亡檢測試劑盒（Abcam Inc.）。細胞培養(yǎng)4、24、48h 后，用Sigma公司的纖維蛋白溶解酶消化鼠角膜緣干細胞共同培養(yǎng)的纖維蛋白，以1 000g 離心4min收集細胞，冷PBS洗2遍后，加入AnnexinⅤ抗體室溫培育5min。采用流式細胞儀檢測細胞凋亡和存活率，未被AnnexinⅤ和DAPI染色的細胞為存活細胞。被Annexin Ⅴ染色的細胞為凋亡細胞。

1.3 Western blot檢測角膜緣干細胞分化蛋白的表達

對C 組的混合細胞，獲得細胞后，加入抗CD16／32抗體于4℃孵育10min阻斷細胞非特異性表面受體，然后加入抗表面抗原mCD49e抗體于4℃孵育30min，采用流式細胞儀分離技術，將表面抗原mCD49e陽性的胚胎成纖維細胞分離出來，剩余的細胞為與之共培養(yǎng)的小鼠角膜緣細胞。對A和B組細胞，用胰蛋白酶消化后，收集細胞。將收獲的3組細胞，用等量的SDS細胞裂解液處理，聚丙烯酰胺凝膠電泳后，將蛋白轉(zhuǎn)到硝酸纖維膜（Bio－Rad Laboratories，Hercules）。硝酸纖維膜用含5%脫脂牛奶的0.05% PBS－tween（PBST）封閉30 min，然后將硝酸纖維膜浸入含一抗Keratin K3／K76（Millipore）的PBST 中，4℃過夜孵育。次日，PBST 清洗膜后，將硝酸纖維膜浸入辣根過氧化物酶偶聯(lián)的兔IgG（Amersham Biosciences，Piscataway）（1∶3 000 稀釋于含5% 脫脂牛奶的PBST中），室溫下孵育2h。采用Western blot化學發(fā)光反應試劑（Perkin－Elmer LAS，Inc.）檢測。膠片曝光后，采用VersaDoc影像系統(tǒng)（Bio－Rad Laboratories）掃描和定量分析。

1.4 統(tǒng)計分析

2 結(jié)果

2.1 細胞存活率和凋亡率檢測

在細胞培養(yǎng)4、24 和48h，C 組細胞存活率最高，其值分別為（95.7±2.0）%、（95.1±1.2）%、（92.0±1.7）%，其凋亡率分別為（2.8±0.4）%、（3.3±0.5）%、（6.2±0.7）%。其次為B 組，其4、24 和48h生存率分別為（95.2±3.0）%、（89.8±1.5）%、（80.0±0.8）%，其凋亡率分別為（3.6±0.4）%、（9.2±0.8）%、（16.2±1.7.）%。存活率最低的組為A 組，其生存率分別為（95.0±1.2）%、（84.5±1.2）%和（70.0±0.9）%，其凋亡率分別為（3.8±0.4）%、（13.5±2.3）%、（27.3±2.7）%。見圖1、2。

圖1 流式細胞術檢測細胞培養(yǎng)24h的凋亡率和存活率Fig.1 Apoptosis and viability of limbal stem cells after culture for 24h

圖2 各組細胞培養(yǎng)不同時間點的存活率Fig.2 Statistical analysis of viability at different time points after culture

2.2 角膜緣干細胞分化蛋白的表達

分別在培養(yǎng)4h和48h后，收獲和分離小鼠角膜緣干細胞，使用Western blot檢測角膜分化蛋白Keratin K3／K76的表達。4h時各組細胞分化標記蛋白表達差異無統(tǒng)計學意義，而培養(yǎng)48h后C組的K3表達低于A 組和B組（n＝3，P＜0.05）。見圖3。

圖3 Western blot檢測各組Keratin K3／K76的表達Fig.3 The expression of Keratin K3／K76detected by using Western blot in different groups

3 討論

角膜緣干細胞在治療各種嚴重的眼表疾病中有著廣闊的應用前景［5］。在嚴重角膜緣干細胞缺乏癥中，角膜緣干細胞移植是臨床醫(yī)生們最后和唯一的治療手段［6－8］。當角膜緣干細胞植入后，最終的治療效果主要取決于干細胞的生存率和它對自我表型的維持能力。由支持細胞和細胞外基質(zhì)蛋白有機組成的微環(huán)境，以及它們的旁分泌作用對干細胞的存活和表型的維持有著決定性的作用［9－11］。在眾多的干細胞培養(yǎng)中，例如鼠和人的胚胎干細胞，沒有成纖維細胞的支持和旁分泌作用，它們很難維持其表型，其分化率和老化率都明顯提高［12－14］。因此，我們猜測這種情形也可能發(fā)生于角膜緣干細胞［15－17］。

優(yōu)化角膜緣干細胞生長的微環(huán)境是角膜緣干細胞移植成功與否以及改善預后的關鍵方法。為了取得更好的效果和預后，眾多研究者使用不同的方法和材料，例如羊膜［18］、人工合成的多聚物等等［19］。本實驗中，我們使用胚胎成纖維細胞與纖維蛋白作為新的手段去優(yōu)化角膜緣干細胞的生長微環(huán)境。我們對3種不同培養(yǎng)模式下細胞的生存率和分化率進行了比較，結(jié)果顯示角膜緣干細胞與纖維蛋白和胚胎成纖維細胞共同培養(yǎng)可以取得最高的生存率和最低的凋亡率，而角膜緣干細胞單獨培養(yǎng)的生存率最低、凋亡率最高。因此我們認為，胚胎成纖維細胞和纖維蛋白可以優(yōu)化鼠角膜緣干細胞的生長，有助于其表型的維持，防止或者減緩其分化。

3D 細胞培養(yǎng)是組織再生醫(yī)學中廣泛使用的活體細胞培養(yǎng)技術，與傳統(tǒng)的2D 細胞培養(yǎng)技術相比較，它能給細胞提供類似機體內(nèi)環(huán)境的機械支持力和生物化學微環(huán)境［20］。本實驗中，我們采用簡單易用的圓錐底培養(yǎng)皿3D 培養(yǎng)技術，在干細胞研究領域，許多研究者也采用它促進干細胞向胚胎小體的分化［21］。通過實驗我們認為它可以增加纖維蛋白、胚胎成纖維細胞和角膜緣干細胞之間的相互作用，模擬角膜緣干細胞移植后的生長環(huán)境。

纖維蛋白是FDA 批準使用于人體的一種生物材料，高濃度的纖維蛋白可以作為粘合劑使用，因此它是適用于3D 培養(yǎng)的理想材料。但是它不含有促進細胞增殖、抑制細胞凋亡和分化的生長因子［22－23］。在本實驗中，我們發(fā)現(xiàn)與纖維蛋白共同培養(yǎng)的角膜緣干細胞的凋亡率低于對照組。因此我們推測纖維蛋白也許可以促進細胞之間的聯(lián)系，優(yōu)化它們的生長微環(huán)境。另外一個原因可能是纖維蛋白可以促進角膜緣干細胞與圓錐培養(yǎng)皿之間的粘附，從而減少角膜緣干細胞的脫落凋亡。由于纖維蛋白凝膠的濃度和硬度也會影響細胞的增殖和分化，高濃度和高硬度的凝膠可以明顯抑制干細胞的增殖，阻止營養(yǎng)和氧氣的滲入，因此在本實驗中我們選用了低濃度和硬度的纖維蛋白凝膠作為我們3D 培養(yǎng)的模型構建材料。

鼠類胚胎成纖維細胞常常被用來作為干細胞培養(yǎng)的支持細胞，在人源性支持細胞和無支持細胞培養(yǎng)模式發(fā)明前，它也是人胚胎干細胞培養(yǎng)的支持細胞［24－25］。雖然它的作用原理還沒有完全明了，但是一些實驗表明目前成纖維細胞分泌的白細胞介素抑制劑，以及基本成纖維細胞生長因子對干細胞的表型維持，分化和凋亡的抑制有著決定性的作用。在本實驗中，與鼠胚胎成纖維細胞共同培養(yǎng)的角膜緣干細胞取得了最高的生存率和最低的凋亡率，它意味著鼠胚胎成纖維細胞在體外培養(yǎng)中對鼠角膜緣干細胞的存活和表型維持有著促進作用，雖然現(xiàn)在具體的分子機制還不是很清楚，但是我們推測其分子機制應該與鼠胚胎成纖維細胞對鼠胚胎干細胞、人胚胎干細胞和誘導干細胞的作用相似。我們進一步推測角膜緣周圍的支持細胞，比如結(jié)膜囊內(nèi)的和Tenon 囊內(nèi)的成纖維細胞應該比胚胎成纖維細胞在促進角膜緣干細胞生存和維持其表型方面有更好的效果，因為它們的生長環(huán)境與角膜緣干細胞更接近。因此，確定適宜的支持細胞種類和數(shù)量對于促進角膜緣干細胞的生存和表型的維持具有重要臨床意義。

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