自噬抑制劑3-MA對(duì)乳胞素抑制胃癌BGC-823細(xì)胞增殖的影響及其機(jī)制

金鎮(zhèn)勛 蘭汝春 王 菲 董長(zhǎng)松 徐 冶 (吉林醫(yī)藥學(xué)院附屬醫(yī)院消化科，吉林 吉林 3203)

細(xì)胞內(nèi)存在兩種主要的蛋白質(zhì)降解途徑，泛素-蛋白酶體途徑和自噬途徑，自噬途徑主要降解長(zhǎng)壽命蛋白，而泛素-蛋白酶體途徑則主要降解短壽命蛋白，這些蛋白包括一些細(xì)胞周期蛋白、轉(zhuǎn)錄因子、抗腫瘤蛋白和促凋亡蛋白。蛋白酶體廣泛存在于真核細(xì)胞中，泛素-蛋白酶體系統(tǒng)是生物體內(nèi)進(jìn)行蛋白質(zhì)選擇性降解的重要途徑之一，泛素-蛋白酶體系統(tǒng)的異?？梢詫?dǎo)致多種疾病的發(fā)生，其中在腫瘤發(fā)展中的作用越來越受到人們的重視。乳胞素(Lactacystin，LAC)是鏈霉菌屬的代謝產(chǎn)物，可以通過細(xì)胞膜，引起不可逆的蛋白酶體抑制〔1〕，被廣泛應(yīng)用于蛋白酶體的研究中〔2～4〕。本研究通過體外培養(yǎng)BGC-823，觀察自噬抑制劑3-MA對(duì)蛋白酶體抑制劑LAC抑制BGC-823細(xì)胞增殖的影響。

1 材料與方法

1.1 材料和試劑 噻唑藍(lán)(MTT)購(gòu)自美國(guó)Sigma公司;胎牛血清(BSA)、IMEM培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)Gibco公司;十二烷基硫酸鈉(SDS)、四甲基乙二胺(TEMED)、丙烯酰胺、N，N-二甲基雙丙烯酰胺、過氧化物酶標(biāo)記二抗購(gòu)自北京鼎國(guó)生物技術(shù)有限公司;β-肌動(dòng)蛋白(β-actin)、細(xì)胞色素 C(Cytochrome C)、半胱氨酸蛋白酶-4(caspase-4)抗體購(gòu)自美國(guó)SANTA CRUZ公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)分組 分為對(duì)照組、3-MA 5 mmol/L組、LAC 5 μmol/L組和 LAC 5 μmol/L+3-MA 5 mmol/L 組。

1.3 MTT法檢測(cè)細(xì)胞存活率 取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的BGC-823細(xì)胞，胰酶消化后800 r/min離心，按每孔含1×104BGC-823細(xì)胞加入96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜使BGC-823細(xì)胞完全貼壁。設(shè)立對(duì)照組以及不同濃度LAC組，每個(gè)LAC濃度9個(gè)重復(fù)孔，LAC作用12 h后每孔加入20 μl MTT，CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育4 h，吸掉96孔板中的培養(yǎng)液，加入150 μl二甲基亞砜(DMSO)，振蕩器振蕩10 min。BIO-TEK酶標(biāo)儀上，選擇490 nm波長(zhǎng)，測(cè)定每孔中吸收值，計(jì)算細(xì)胞增殖率。對(duì)照組細(xì)胞存活率為100%，加藥各組存活率=(各濃度組A值/對(duì)照組A值)×100%。

1.4 Western印跡法檢測(cè)各組細(xì)胞 β-actin、Cytochrome C、caspase-4蛋白表達(dá)水平 (1)蛋白的提?。禾幱趯?duì)數(shù)生長(zhǎng)期的BGC-823細(xì)胞，待細(xì)胞生長(zhǎng)到培養(yǎng)瓶70%時(shí)，隨即將4瓶細(xì)胞分為4組，作用12 h后，胰酶消化離心，每瓶加入120 μl預(yù)先冷卻的細(xì)胞裂解液(RIPA)，混勻，細(xì)胞粉碎儀超聲粉碎2次，每次5 s，4℃作用60 min，3 000 r/min離心收集上清。(2)蛋白濃度測(cè)定：根據(jù)說明書，利用BSA測(cè)定各組蛋白濃度。(3)蛋白質(zhì)的變性：每管加入30 μl 5×上樣緩沖液，煮沸變性。(4)丙烯酰胺凝膠電泳：將每組蛋白緩慢加入加樣孔中，加入電泳液，濃縮膠80 V，25 min;分離膠160 V，45 min。電泳結(jié)束后，根據(jù)目的蛋白分子量的不同剪切分離膠。轉(zhuǎn)膜，首先放置1層海綿2層濾紙，然后放入分離膠，聚偏氟乙烯(PVDF)膜，最后上面再放置2層濾紙和1層海綿，放入冰盒，倒入足夠的轉(zhuǎn)膜液，100 V，55 min。轉(zhuǎn)膜結(jié)束后取出PVDF膜，放入5%脫脂奶粉封閉2 h。封閉結(jié)束后用磷酸鹽緩沖液(PBS)洗膜3次，每次5 min，然后加入相應(yīng)一抗 (β-actin、Cytochrome C、caspase-4;1∶200稀釋)，4℃冰箱過夜，次日回收一抗，PBS洗膜3次，時(shí)間分別為1×15 min、2×5 min，加入過氧化物酶標(biāo)記的相應(yīng)二抗(1∶1 000稀釋)搖床搖2 h，二氮基聯(lián)苯胺(DAB)顯色。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS12.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件，各組之間各項(xiàng)檢測(cè)指標(biāo)比較采用t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 單獨(dú)應(yīng)用LAC以及聯(lián)合應(yīng)用3-MA對(duì)各組胃癌BGC-823細(xì)胞增殖率的影響 MTT結(jié)果顯示，與Control組(100%)相比，LAC 5 μmol/L可以引起細(xì)胞增殖下降，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。同時(shí)聯(lián)合應(yīng)用 LAC 5 μmol/L和 3-MA 5 mmol/L可以進(jìn)一步引起細(xì)胞增殖率的下降，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。

2.2 各組BGC-823細(xì)胞Cytochrome C表達(dá)水平 單獨(dú)應(yīng)用蛋白酶體抑制劑LAC可以引起線粒體凋亡相關(guān)蛋白Cytochrome C表達(dá)水平升高，而聯(lián)合應(yīng)用LAC和3-MA時(shí)，Cytochrome C表達(dá)水平進(jìn)一步升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。提示3-MA可以增加LAC引起的線粒體凋亡。見圖1。

2.3 各組BGC-823細(xì)胞caspase-4表達(dá)水平 單獨(dú)應(yīng)用蛋白酶體抑制劑LAC可以引起caspase-4表達(dá)水平的升高，而聯(lián)合應(yīng)用LAC和3-MA時(shí)，caspase-4表達(dá)水平進(jìn)一步升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。提示3-MA可以增加LAC引起的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)介導(dǎo)的凋亡。見圖2。

圖1 各組BGC-823細(xì)胞Cytochrome C蛋白表達(dá)比較

圖2 各組BGC-823細(xì)胞caspase-4蛋白表達(dá)比較

3 討論

蛋白質(zhì)的新陳代謝對(duì)于維持正常的細(xì)胞功能，促進(jìn)細(xì)胞存活極其重要。泛素-蛋白酶體途徑在降解陳舊蛋白質(zhì)從而促進(jìn)蛋白質(zhì)的新陳代謝中發(fā)揮重要的作用。細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)降解必須由精確的時(shí)間和空間來調(diào)節(jié)。泛素-蛋白酶體途徑由泛素(Ub)、泛素活化酶(E1)、泛素結(jié)合酶(E2)、泛素-蛋白連接酶(E3)、26S蛋白酶體和泛素解離酶(DUBs)等組成。泛素蛋白酶體對(duì)蛋白質(zhì)的降解是一個(gè)連續(xù)的過程〔5〕。E1首先催化泛素使其C-末端甘氨酸殘基與E1的半胱氨酸殘基間形成高能硫酯鍵而活化?；罨腅1-泛素結(jié)合的中間體再將泛素轉(zhuǎn)移給泛素結(jié)合酶E2，從而形成E2-泛素中間體。最后一步，泛素-蛋白連接酶E3與靶蛋白結(jié)合，促使泛素分子相繼連接到靶蛋白上，形成一條多泛素鏈〔6〕。如果蛋白質(zhì)降解出現(xiàn)了異常，將會(huì)導(dǎo)致嚴(yán)重的細(xì)胞生長(zhǎng)障礙，包括增殖和分化的障礙，同時(shí)，泛素蛋白酶體的異常還可以誘導(dǎo)多種疾病的發(fā)生。蛋白酶體抑制劑LAC通過阻止細(xì)胞內(nèi)20 S蛋白酶體與蛋白起接觸反應(yīng)的β亞單位，從而有效專一抑制 20S蛋白酶體活性〔7～9〕。

本研究通過體外培養(yǎng)胃癌BGC-823細(xì)胞，利用蛋白酶體抑制劑LAC可以明顯地引起B(yǎng)GC-823細(xì)胞增殖率的下降，聯(lián)合應(yīng)用自噬抑制劑3-MA可以增加LAC引起的細(xì)胞增殖率的下降。本文進(jìn)一步利用Western印跡方法檢測(cè)了線粒體凋亡相關(guān)蛋白Cytochrome C以及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)凋亡相關(guān)蛋白caspase-4變化，LAC可以引起線粒體凋亡相關(guān)蛋白Cytochrome C以及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)凋亡相關(guān)蛋白caspase-4表達(dá)水平升高，當(dāng)聯(lián)合應(yīng)用自噬抑制劑3-MA時(shí)，可以進(jìn)一步引起Cytochrome C和caspase-4升高，提示3-MA可以增加LAC引起的細(xì)胞凋亡。以上結(jié)果表明，同時(shí)抑制蛋白酶體降解途徑和自噬降解途徑，能更加有效地抑制BGC-823細(xì)胞增殖，這一機(jī)制為胃癌治療提供了新的思路。

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