地骨皮總黃酮的提取及酪氨酸酶活性抑制研究

陳志春，王英豪

（1.福州屏山制藥廠，福建 福州 350003；2.福建中醫(yī)藥大學(xué)，福建 福州 350122）

地骨皮總黃酮的提取及酪氨酸酶活性抑制研究

陳志春1，王英豪2

（1.福州屏山制藥廠，福建 福州 350003；2.福建中醫(yī)藥大學(xué)，福建 福州 350122）

目的 優(yōu)選地骨皮總黃酮的提取工藝及其對酪氨酸酶活性的抑制。 方法 采用L9（34）正交表設(shè)計實驗，以地骨皮總黃酮為考察指標(biāo)，采用紫外分光光度法測定其含量，優(yōu)選提取工藝；采用多巴速率氧化法，測定其對酪氨酸酶活性的影響。 結(jié)果 乙醇濃度對提取效果具有顯著性影響（P＜0.05），經(jīng)優(yōu)化后的最佳提取工藝條件為：4倍量50%乙醇，提取3次，每次1 h。 結(jié)論 優(yōu)選工藝得到的地骨皮總黃酮含量高，且總黃酮具有較強的酪氨酸酶活性抑制作用。

地骨皮；總黃酮；紫外分光光度法；酪氨酸酶

地骨皮為茄科植物枸杞Lycium chinense Mil1．或?qū)幭蔫坭絃ycium barbarum L.的干燥根皮，其名始見于《外臺秘要》，是以根的形狀象細的骨頭而命名的。地骨皮性寒、味甘，歸肺、肝、腎經(jīng)，具有涼血除蒸、清肺降火之功效，用于陰虛發(fā)熱、盜汗骨蒸、肺熱咳嗽、血熱出血、內(nèi)熱消渴等證［1-2］。現(xiàn)代藥理研究表明地骨皮主要具有降血壓、降血糖、調(diào)血脂、解熱、抗菌及抗病毒等活性［2-3］，藥用價值非常明顯。前期試驗我們證實了地骨皮能抑制酪氨酸酶活性，具有祛斑美白作用［4］。為了便于對地骨皮深入研究，本文對其黃酮類物質(zhì)的提取方法及提取液的酪氨酸酶活性抑制作用進行了研究，為其進一步開發(fā)利用提供科學(xué)依據(jù)。

1 儀器與試劑

紫外-可見分光光度計（UV-9100，北京瑞利分析儀器公司）；電子分析天平（FA20004N，上海精密科學(xué)儀器有限公司）；蘆丁對照品（中國藥品生物制品檢定所，批號：100080-200707）；地骨皮藥材購于福建中醫(yī)藥大學(xué)國醫(yī)堂；亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉、無水乙醇等均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 地骨皮總黃酮的提取工藝

2.1.1 對照品溶液的制備 精密稱取蘆丁對照品10 mg，置50 mL量瓶中，加70%乙醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，得濃度為0.2 mg／mL的蘆丁對照品液。

2.1.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立［4］分別精密吸取蘆丁對照品液 0.5、1.0、2.0、4.0、8.0 mL 于 25 mL 容量瓶中，均加入70%乙醇至10 mL；再加入5%的亞硝酸鈉溶液0.7 mL，搖勻，放置6 min；再加入10%的硝酸鋁溶液0.7 mL，搖勻，放置6 min；再加入4%的氫氧化鈉溶液5.5 mL，用70%乙醇定容至刻度，搖勻，放置15 min后，以70%乙醇作參比溶液，于波長510 nm處測定吸光度。以吸光度值（A）為縱坐標(biāo)，蘆丁對照品含量為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。得回歸方程：Y＝0.498X－0.0073（R＝0.9999），結(jié)果表明蘆丁在 0.1～1.6 mg范圍內(nèi)呈良好線性關(guān)系，見圖1、表1。

表1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線考察結(jié)果

2.1.3 樣品的制備 取地骨皮等量9份，按L9（34）正交試驗條件回流提取，濾過，合并濾液，回收乙醇并濃縮，定容于25 ml容量瓶中。L9（34）正交試驗表頭設(shè)計見表2、表3。

表2 因素水平表

2.1.4 樣品總黃酮含量測定 精密吸取樣品液0.25 mL于25 mL容量瓶中，按2.1.2中的方法顯色，測定吸光度值，計算總黃酮含量。結(jié)果見表3。

表3 正交試驗結(jié)果表

2.1.5 正交結(jié)果分析 對正交試驗所得結(jié)果作直觀分析和分差分析，以判斷各因素對提取效果的影響程度，篩選出在該試驗條件下最優(yōu)的提取條件。直觀分析結(jié)果見圖2，方差分析結(jié)果見表4。

表4 方差分析表

由直觀分析可知，各因素水平優(yōu)劣分別為A1＞A2＝A3；B1＞B3＞B2；C3＞C2＞C1；D3＞D2＞D1，即乙醇濃度50%優(yōu)于75%和90%；乙醇用量4倍優(yōu)于6倍優(yōu)于5倍；提取時間1.5 h優(yōu)于1 h和0.5 h；提取次數(shù)3次優(yōu)于2次優(yōu)于1次。極差R值大小顯示，各因素作用主次為A＞D＞C＞B。方差分析結(jié)果表明：A因素、D因素的影響具有顯著性意義（P＜0.05），最后確定最佳提取工藝為A1B1C2D3。

2.2 地骨皮總黃酮對酪氨酸酶活性的影響

2.2.1 酪氨酸酶活性的測定 采用蘑菇酪氨酸酶多巴速率氧化法檢測［5］，反應(yīng)混合物與體積見表5。

測定時，用移液管按表5所示體積，分別吸取a、b、c、d 4組反應(yīng)液的前3種于容量瓶中，溫育后加入L-多巴反應(yīng)2 min時測定吸光度（A475）值。以磷酸鹽緩沖液（PBS）為空白，以不加藥物的反應(yīng)組為對照，分別測定4份已知總黃酮含量的樣品液對酪氨酸酶（Tyr）活性的抑制率。實驗重復(fù)3次，取平均值，按下式計算酪氨酸酶的抑制率，結(jié)果見圖3。

酪氨酸酶抑制率 ／%＝［（A475a－A475b）－（A475c－A475d）］／（A475a－A475b）×100%

式中：a為未加中藥的加酶混合液；b為未加中藥和酶的混合液；c為加中藥和酶的混合液；d為加中藥而未加酶的混合液。

表5 反應(yīng)混合物與體積mL

2.2.2 地骨皮總黃酮對酪氨酸酶活性的影響 取已知總黃酮含量的樣品液4份，按2.2.1測定其對酪氨酸酶的抑制作用，結(jié)果見圖3。結(jié)果顯示隨著地骨皮總黃酮含量的增高，其對酪氨酸酶的抑制也增高，存在一定的量效關(guān)系。

2.3 驗證試驗 為確證該工藝的優(yōu)劣和穩(wěn)定性，按篩選的最佳條件，平行制備3份地骨皮樣品液，精密吸取樣品液0.25 mL于25 mL容量瓶中，按2.1.2中的方法顯色，測定吸光度值，計算總黃酮含量，并測定總黃酮對酪氨酸酶的抑制率。驗證結(jié)果見表6。

表6 驗證試驗結(jié)果

驗證試驗結(jié)果說明：所篩選的提取工藝條件基本穩(wěn)定。

3 討 論

3.1 最佳工藝的確定 本文采用L9（34）正交設(shè)計優(yōu)選地骨皮總黃酮含量的最佳提取條件，結(jié)果由R值可知地骨皮的提取條件以A1B12C3D3組合為最佳，但鑒于成本與時間，并且提取時間對總黃酮含量影響甚小，無顯著性差異，故改為提取時間1 h，即最后確定最佳提取工藝為50%乙醇4倍量提取3次，每次1 h。由于乙醇濃度、提取次數(shù)對工藝有顯著影響，今后做進一步放大實驗或工業(yè)生產(chǎn)中，應(yīng)特別注意乙醇濃度。

3.2 測定方法的選擇 地骨皮所含的黃酮類化合物能與金屬鋁離子螯合成絡(luò)合物而顯紅色，在510 nm處形成新的吸收峰，故本文以蘆丁為對照品，采用亞硝酸鈉-硝酸鋁-氫氧化鈉法，測定了地骨皮藥材中總黃酮含量。結(jié)果三批樣品中總黃酮的含量較為接近，且具有較強的酪氨酸酶活性抑制作用。

3.3 應(yīng)用前景 前期試驗我們證實了地骨皮能抑制酪氨酸酶活性，具有祛斑美白作用［4］，其機制可能為黃酮化合物作為酪氨酸酶的底物替代劑，取代酶的作用，達到抑制黑素的目的。本研究采用正交設(shè)計對地骨皮總黃酮提取工藝進行優(yōu)化，并對最佳工藝進行了驗證實驗。結(jié)果證明：隨著總黃酮含量的增高，酪氨酸酶活性抑制率亦增強，為進一步開發(fā)利用地骨皮提供了理論依據(jù)。

［1］國家藥典委員會.中國藥典（一部）［M］.北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2010：115.

［2］劉洪超，郭慶梅，周鳳琴.地骨皮的功效考證與現(xiàn)代藥理學(xué)研究比較［J］.山東中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報，2009，33（6）：533-534.

［3］國家中醫(yī)藥管理局《中華本草》編輯委員會.中華本草［M］.7冊.北京：科學(xué)與技術(shù)出版社，1999：274.

［4］王英豪，魏國強，張理平.馬齒莧總黃酮含量測定方法的建立［J］.福建中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報，2012，22（2）：44-45.

［5］張理平，張海燕，王英豪，等.28味中藥酸性成分提取物影響黑素合成的實驗研究［J］. 中華中醫(yī)藥雜志，2009，24（11）：1443-1445.

R284.2

A

1000-338X（2012）04-0054-03

2012-5-20

福建省教育廳科技資助項目（JA10172）

陳志春（1969—），男，主管藥師，主要從事中藥管理與研究工作。

王英豪，男，講師。 E-mail：39887219@qq.com