3種天然藥物治療幽門螺桿菌感染小鼠的體內研究

羅 萍，周曾芬

（1.湖南省懷化市第一人民醫(yī)院，湖南 懷化 418000；2.昆明醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院，云南 昆明 650032）

幽門螺桿菌（H.Pylori，Hp）感染是胃十二指腸潰瘍的常見原因，包括中國人在內的亞洲人群具有高的幽門螺桿菌感染率。很大一部分患者接受Hp 根除治療后出現(xiàn)消化系潰瘍的好轉甚至痊愈，進一步提示了該治療的作用。天然藥物由于不良反應小、較易制備、價廉等優(yōu)點，尤其適合我國患者。云南天然藥物資源豐富，我們在前期研究的基礎上，根據(jù)不用藥物的特點，選取新鮮大蒜汁、魚腥草水煎劑、吳茱萸水煎劑3種天然藥物在Hp 感染小鼠模型中進行體內實驗，以明確其抗Hp 作用及不良反應，為將云南天然藥物應用于Hp 根除治療奠定基礎。

1 材料和方法

1.1 Hp 感染小鼠模型制備

1.1.1 實驗動物 BALB／c 小鼠190 只，6～8 周齡，重17～20 g，雌雄各半，購自昆明醫(yī)學院動物中心。在本院實驗樓動物科清潔級飼養(yǎng)，室溫（23±2）℃，相對濕度為（55±5）%，每天光照黑暗交替各12 h。自由進食、飲水。

1.1.2 H.Pylori 菌株及培養(yǎng)分別選用昆明醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院保種的十二指腸潰瘍（DU）患者胃內分離的H.Pylori（CagA＋、VacA＋）3-21 菌株，在空腸彎曲菌瓊脂平板上復蘇，轉種于腦心浸液培養(yǎng)基中，應用液體培養(yǎng)法增菌：微氧條件37℃培養(yǎng)72 h，取少量培養(yǎng)液涂片，革蘭染色后觀察細菌形態(tài)并檢測尿素酶、過氧化氫酶和氧化酶水平。確認為陽性后，將細菌濃度調整到1×109CFU／mL，立即接種BALB／c 小鼠。

1.1.3 模型建立方案 同齡BALB／c 小鼠在昆明醫(yī)學院附屬第一醫(yī)院動物科適應飼養(yǎng)1 周，自由進食，飲水。根據(jù)性別分層后隨機分為2組，雌雄均各半，各組間小鼠體重經檢驗無統(tǒng)計學差異。

1.1.3.1 正常對照組（35 只）口服0.2 mol／L 碳酸氫鈉0.25 mL，15 min 后用胃管灌喂腦心浸液0.4 mL／次，每日灌喂1次，連續(xù)5 d。灌喂前先禁食禁水12 h，灌喂后禁食禁水2 h，然后自由進食、飲水。

1.1.3.2 病理模型組（155 只）口服0.2 mol／L 碳酸氫鈉0.25 mL，15 min 后用胃管灌喂?jié)舛葹?×109CFU／mL H.Pylori 3-21 菌株0.4 mL／次，每日灌喂1次，連續(xù)5 d。灌喂前先禁食禁水12 h，灌喂后禁食禁水2 h，然后自由進食、飲水。

1.1.3.3 最后1次灌喂H.Pylori 菌株后繼續(xù)飼養(yǎng)4周，后隨機抽取對照組及實驗組小鼠各5 只處死。證實造模成功后進行下一步的治療。

1.2 治療方案

1.2.1 治療藥物分為4組，分別是新鮮大蒜汁（濃度為0.78 mg／mL）、魚腥草水煎劑（濃度為0.25 g／mL）、吳茱萸水煎劑（濃度為0.5 g／mL）、三聯(lián)藥物（新鮮大蒜汁0.39 g／mL、魚腥草水煎劑0.125 g／mL、吳茱萸水煎劑0.25 g／mL 按1∶1∶1 混勻）。

1.2.2 治療方案 將病理模型組小鼠隨機分為6組。A組（30 只）：經口灌胃新鮮大蒜汁0.5 mL／只，1次／d，共1 周；B組（30 只）：經口灌胃魚腥草水煎劑0.5 mL／只，1次／d，共1 周；C組（30 只）：經口灌胃吳茱萸水煎劑0.5 mL／只，1次／d，共1 周；D組（30只）：經口灌胃三聯(lián)藥物0.5 mL／只，1次／d，共1 周，E組（30 只）：病理模型對照組，經口灌胃腦心浸液0.5 mL／只，1次／d，共1 周。F組（30 只）：正常對照組，經口灌胃腦心浸液0.5 mL／只，1次／d，共1 周。

1.2.3 療效評價 治療結束后1 周、1個月各處死小鼠15 只，聯(lián)合應用快速尿素酶試驗、細菌培養(yǎng)和組織病理學方法檢測H.Pylori 治療后的感染情況。

1.3 小鼠治療前后H.Pylori的檢測和鑒定

1.3.1 動物處死和組織標本處理 小鼠處死前禁食、禁水12 h，脫頸處死后，打開腹腔取出全胃，沿大彎剖開，肉眼觀察胃黏膜改變，取3 小塊幽門腺黏膜組織分別進行H.Pylori 檢測：1 塊做快速尿素酶鑒定，2 塊置于H.Pylori 保存液中以做培養(yǎng)用。余下胃黏膜組織置于10%甲醛中固定，石蠟包埋，切片后做HE 染色和改良Gimasa 染色。

1.3.2 細菌學培養(yǎng) H.Pylori 培養(yǎng)以空腸彎曲菌選擇性瓊脂為基礎，加入10%的凍融羊血和選擇性抗生素（鹽酸萬古霉素0.25 mg／mL，TMP 0.15 mg／mL，多粘霉素B 0.25 mg／mL，兩性霉素B 0.25 mg／mL）制成培養(yǎng)皿，置4℃冰箱保存。取小鼠胃黏膜勻漿0.2 mL 于血平板上，用研磨器涂勻，微需氧培養(yǎng)72 h 后觀察。

1.3.3 病理檢查 10%甲醛固定的胃組織，石蠟包埋，連續(xù)垂直切片。HE 染色，觀察小鼠胃黏膜的炎癥程度；改良Gimasa 染色，觀察組織切片中的H.Pylori。H.Pylori的定植密度均根據(jù)2000年5月中華醫(yī)學會消化病學分會制定標準。由兩名不知菌株背景的病理科高級職稱醫(yī)師盲法讀片。

1.3.4 限制性酶切片段多態(tài)性PCR（PCR-RFLP）以比較定植前所用菌株與定植后小鼠感染菌株為同一菌株。

1.3.5 胃黏膜病變的觀察 肉眼觀察胃內病變，記錄是否有黏膜的糜爛、出血和潰瘍。

1.3.6 H.Pylori 感染的判定 采用快速尿素酶、細菌培養(yǎng)、組織學觀察（改良Gimasa 染色）和PCRRFLP 2項或2項以上陽性或組織學陽性判定為H.Pylori 感染。

1.4 統(tǒng)計學處理 數(shù)據(jù)應用SPSS 11.0 軟件進行統(tǒng)計學處理。分別采用雙尾Fisher′s 精確概率檢驗、t檢驗和方差分析進行統(tǒng)計學處理。

2 結 果

2.1 模型的建立 快速尿素酶試驗、細菌學培養(yǎng)、病理學檢查、大體標本觀察實驗組、對照組及PCRRFLP 結果見表1、圖1、圖2。結果證實Hp 感染小鼠模型成功建立，且感染效率達到100%。

表1 H.Pylori 感染BALB／c 小鼠情況

病理模型組與正常對照組比較：χ2（連續(xù)校正χ2值）＝6.400，P＝0.011。

圖1 H.Pylori 感染BALB／c 小鼠胃黏膜組織切片HE 染色（中度炎癥反應）

實驗組改良Gimasa 染色可清楚顯示H.Pylori，H.Pylori 呈多桿狀，“S”型，海鷗狀較少見。多位于胃小凹上半部及胃腺腔內，以胃竇為主。對照組動物均未找見H.Pylori。

2.2 不同方案藥物治療后Hp 根除率 治療結果見表2、表3。三藥聯(lián)合治療的有效率達到86.67%，明顯優(yōu)于單藥治療組，這部分實驗同時還證實了三藥聯(lián)合治療的優(yōu)勢在治療后就很快顯示出來。

圖2 H.Pylori 感染BALB／c 小鼠胃黏膜組織切片Geimsa 染色

表2 治療后小鼠總體H.Pylori 感染及治療效果

表3 治療后1 周及4 周H.Pylori 感染BALB／c 小鼠及天然藥物治療效果

治療相關不良反應：僅在新鮮大蒜汁治療組中有一只小鼠出現(xiàn)食欲差，在治療結束后飲食恢復正常。其余小鼠未出現(xiàn)異常。

細菌學培養(yǎng)、病理學檢查（改良Giemsa 染色）、快速尿素酶檢測。上述細菌學培養(yǎng)陰性或后2項及以上陰性判定為HP 清除。

3 討論

大量的體外實驗和我們的研究證實、新鮮大蒜汁、魚腥草、吳茱萸等有抑制幽門螺桿菌作用，然而由于建立穩(wěn)定、經濟而且能真實模擬人胃感染H.Pylori 動物模型的困難，對天然藥物的體內抑菌實驗報道在國內外尚少。

良好的動物感染模型的建立是該研究的前提基礎。盡管恒河猴、平頂猴、蒙古沙鼠及雪貂等是H.Pylori的天然宿主，但由于價格高、數(shù)量少、飼養(yǎng)條件高等因素限制，不適于做理想的動物模型研究［1-3］。國內常用的有狗、大鼠、沙鼠等感染率不是很理想，并且感染的穩(wěn)定性和重復性尚存在不同程度的問題［4－5］。小鼠體型小、易繁殖、來源便利、屬系多樣，是作為動物模型的較好材料［6-8］。近幾年出現(xiàn)的H.Pylori BALB／c 小鼠［9］模型由于其可產生與人相似的病理變化，且高定植量有利于評價藥物根除H.Pylori的療效，對H.Pylori 疫苗的抗原篩選及治療性免疫的研究具有重要的應用價值，因此本實驗利用BALB／c 小鼠作為我們的動物模型小鼠。

本實驗采用經篩選的云南本地區(qū)臨床分離培養(yǎng)毒株H.Pylori（CagA＋、VacA＋）3-21 菌株，預先灌胃碳酸氫鈉中和部分胃酸，PH 值升高，改善H.Pylori定植的生理環(huán)境，從而使H.Pylori 成功的定植在BALB／c 小鼠胃黏膜上并引起與人感染相似癥狀。這可能是H.Pylori 定植后致胃壁細胞等胃腺細胞壞死破裂，使胃酸分泌下降，PH 值升高，更易于PH 定植［10］。我們采用的H.Pylori 菌株是經過多次傳代（＞10次）菌株，均能定植于BALB／c 小鼠，否定了傳代菌株不易在小鼠胃內定植的推論［11］。并且通過PCRRFLP 檢測定植前所用菌株與定植后小鼠感染菌株為同一菌株，即H.Pylori 3-21 菌株，從而避免了胃內可能存在的其他彎曲菌的感染而影響實驗結果的可靠性。

有關大蒜各種劑型對幽門螺桿菌的體外抑菌作用報道較多，然而體內的實驗療效并不一致。周曾芬等［12］運用鮮大蒜對云南地區(qū)379 名農村人群H.Pylori 感染進行前瞻性研究，結果表明：食用鮮大蒜能有效的降低H.Pylori的感染率，其療效與經典含鉍三聯(lián)療法相當；而且有成本花費最小、無耐藥性、無不良反應等 優(yōu)點。Graham DY 等［13］讓10 位 無癥狀H.Pylori 感染陽性的受試者服用鮮大蒜，同時另外11 位受試者服用鉍劑，研究結果卻不表明鮮大蒜有抗H.Pylori 作用。Gail B 等［14］卻對Graham D的臨床實驗提出異議，指出Graham D的臨床實驗所用大蒜是鮮大蒜，而不是加工過的有一定濃度的鮮大蒜汁，同時指出天然植物的治療效果取決于在體內的累積效應，可能要8～12 周以后才能觀察到明顯的治療效果。Iimuro 等［15］用大蒜提取液治療蒙古沙土鼠H.Pylori 感染性胃炎，治療后觀察到H.Pylori 感染數(shù)量無明顯減輕，但胃部出血點及炎癥范圍明顯減輕，提示大蒜提取液在治療H.Pylori 感染引起的胃炎有一定療效，而對H.Pylori 無根除作用。

有關吳茱萸對幽門螺桿菌的體內抑菌作用報道較少，但其體內的實驗療效較一致。Norio Hamasaki等［16］證實吳茱萸提取物中的兩種生物堿對H.Pylori都具有高度敏感性，而且對腸道中的其他細菌沒有抑制作用。Higuchi K 等［17］用吳茱萸、奧美拉唑和阿莫西林治療H.Pylori 感染的患者，同時用奧美拉唑和阿莫西林治療的效果作為對照，結果發(fā)現(xiàn)：加用吳茱萸后的治療效果好于對照組（P＜0.05），用吳茱萸治療H.Pylori 感染效果是明顯的，值得進一步研究。

本課題在國內外首次研究了新鮮大蒜汁、魚腥草水煎劑及3種天然藥物聯(lián)合對H.Pylori 感染小鼠進行治療，得到了較滿意的結果。不同天然藥物單獨治療H.Pylori 抗?jié)兗皬桶l(fā)療效報道不一，但其根除率介于13.3%～70.0%，治療療效尚難滿意［18］。天然藥物聯(lián)合應用可起協(xié)同效應，提高治療療效［19］。在我們的研究中，把具有中等抑菌效果的新鮮大蒜汁、魚腥草、吳茱萸聯(lián)合進行體內抑菌，其根除率可達85%。與單味魚腥草、吳茱萸水煎劑療效有顯著性差異，即聯(lián)合用藥效果優(yōu)于單劑治療的效果，這將為我們以后天然藥物的開發(fā)及臨床應用奠定了堅實的理論基礎。

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