厄貝沙坦片的人體生物等效性研究

程春燕，李 珍＊，張逸凡，李松華

（1.第二軍醫(yī)大學(xué)長(zhǎng)海醫(yī)院藥學(xué)部，上海200433；2.中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)院藥物研究所藥物代謝研究中心，上海201203；3.第二軍醫(yī)大學(xué)長(zhǎng)海醫(yī)院心血管內(nèi)科，上海200433）

［本文編輯］陽(yáng)凌燕

厄貝沙坦（irbesartan）是一種口服血管緊張素Ⅱ受體拮抗劑，在高血壓、充血性心力衰竭等的治療中發(fā)揮著重要作用，有降壓作用顯著、藥物不良反應(yīng)小，口服吸收良好等優(yōu)點(diǎn)［1，2］。本研究采用 LC－MS／MS法［3］測(cè)定24例健康受試者口服厄貝沙坦片（受試制劑）和原研廠生產(chǎn)的厄貝沙坦片（參比制劑）的血藥濃度，求算藥動(dòng)學(xué)參數(shù)和相對(duì)生物利用度，并進(jìn)行生物等效性評(píng)價(jià)，為臨床合理用藥提供依據(jù)。

1 受試對(duì)象和試藥

1.1 受試對(duì)象 24例男性健康受試者，年齡（20.6±1.0）歲，體 重（66.42±5.59）kg，身 高（172.79±4.88）cm，體重指數(shù)（22.22±1.18）kg／m2，試驗(yàn)前體格檢查和實(shí)驗(yàn)室檢查均未見異常，無(wú)藥物與食物過(guò)敏史，無(wú)煙、酒嗜好及濫用毒品史，篩選前2周內(nèi)未服用過(guò)可能影響本研究結(jié)果的藥物，入選前3個(gè)月內(nèi)未參加過(guò)其他藥物臨床試驗(yàn)且無(wú)獻(xiàn)血史。試驗(yàn)方案經(jīng)第二軍醫(yī)大學(xué)長(zhǎng)海醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)后實(shí)施。所有受試者均簽署知情同意書。

1.2 藥品和試劑 受試制劑：厄貝沙坦片（江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司，0.15g／片，批號(hào)080306518）；參比制劑：厄貝沙坦片（商品名 安博維，杭州賽諾菲安萬(wàn)特民生制藥有限公司，0.15g／片，批號(hào)1805）。厄貝沙坦對(duì)照品（中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)100607－200301，純度99.9%）；氯沙坦鉀對(duì)照品（深圳倍素特公司，批號(hào)1370462，純度99.9%）；甲醇和乙腈為色譜純（美國(guó)Sigma公司）；醋酸銨和甲酸為色譜純（美國(guó)Tedia公司）；水由法國(guó)Millipore公司純水機(jī)制備。

2 方法和結(jié)果

2.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)和血樣采集 24例男性健康受試者隨機(jī)分成2組，每組12人。受試者禁食至少10h，次日晨空腹用200ml溫開水送服0.15g片劑，一組服用受試制劑，另一組服用參比制劑。受試者服藥后2h內(nèi)禁水，4h后給予統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)餐。7d的清洗期后，兩組受試者交叉服用藥物，于服藥前和服藥后0.5、1、1.5、2、2.5、3、4、6、8、12、16、24、36h 于肘靜脈采血2ml，肝素抗凝，9×102×g離心10min，分取血漿于－20℃冰箱保存。

2.2 血藥濃度測(cè)定方法

2.2.1 儀器 Agilent 1100液相色譜系統(tǒng)（包括G1311A型四元輸液泵、G1367A型自動(dòng)進(jìn)樣器、G1316A型柱溫箱和G1322A型脫氣機(jī)，美國(guó)Agilent公司）；TSQ Quantum Ultra型三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜儀，配備電噴霧電離源（ESI源），數(shù)據(jù)采集使用Xcalibur 2.0.7軟件（美國(guó) Thermo Finnigan公司）。

2.2.2 色譜條件和質(zhì)譜條件 色譜柱為Zorbax SB C18柱（150mm×4.6mm，5μm，美國(guó) Agilent公司）；C18保護(hù)柱（3.0mm×4.0mm，5μm，美國(guó)Phenomenex公司）；流動(dòng)相為乙腈－水－甲酸（90∶10∶0.25）；流速為0.5ml／min，柱溫為20℃。離子源為電噴霧電離源，源噴射電壓4.0kV，加熱毛細(xì)管溫度為320℃，鞘氣（N2）壓力為0.6MPa，輔助氣（N2）流 量 4.8L／min，碰撞氣（Ar）壓 力0.16Pa。厄貝沙坦和內(nèi)標(biāo)氯沙坦鉀的碰撞誘導(dǎo)解離（CID）電壓分別為20和45eV，正離子方式檢測(cè)，掃描方式為選擇反應(yīng)監(jiān)測(cè)（SMR）。用于定量分析的離子反應(yīng)分別為厄貝沙坦m／z429→207和氯沙坦m／z423→207，掃描時(shí)間為0.3s。

2.2.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制 精密稱取厄貝沙坦對(duì)照品適量，用甲醇溶解并配成濃度為1.00mg／ml的厄貝沙坦儲(chǔ)備液Ⅰ。取200μl儲(chǔ)備液Ⅰ，用甲醇∶水（50∶50）稀釋至 1.00ml，得厄貝沙坦?jié)舛葹?00μg／ml的儲(chǔ)備液Ⅱ，再以甲醇∶水（50∶50）稀釋得 濃 度 依 次 為 8、4、1.6、0.4、0.16、0.04、0.012μg／ml的厄貝沙坦系列標(biāo)準(zhǔn)溶液。同法制備濃度為6.4、0.4、0.03μg／ml的質(zhì)控樣品。以甲醇溶解并稀釋，制得濃度為1μg／ml的氯沙坦鉀內(nèi)標(biāo)溶液。各儲(chǔ)備液、系列標(biāo)準(zhǔn)溶液、質(zhì)控溶液及內(nèi)標(biāo)溶液均以相應(yīng)體積，經(jīng)校正的移液器和容量瓶配制，并在4℃冰箱內(nèi)保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2.4 血漿樣品的預(yù)處理 向100μl血漿中分別加入50%甲醇溶液50.0μl，內(nèi)標(biāo)溶液25.0μl（1μg／ml氯沙坦溶液）和200μl乙腈，渦旋混勻，8.6×103×g離心5min。取100μl上清液于40℃空氣流下吹干。殘留物溶于200μl流動(dòng)相中，取10 μl進(jìn)行LC－MS／MS分析。

2.2.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線及最低定量濃度的確定 取空白血漿100μl，配制成相當(dāng)于厄貝沙坦血漿濃度為0.006、0.02、0.08、0.2、0.8、2.0和4.0μg／ml的樣品，按2.2.4項(xiàng)下操作，每一濃度進(jìn)行雙樣本分析，進(jìn)樣10μl，記錄色譜圖。以待測(cè)物濃度為橫坐標(biāo)（X），待測(cè)物與內(nèi)標(biāo)物的峰面積比值為縱坐標(biāo)（Y），用加權(quán)最小二乘法進(jìn)行回歸運(yùn)算，加權(quán)系數(shù)W＝1／x2?；貧w方程為Y＝1.72×10－2X＋4.37×10－3，r＝0.999 6，厄貝沙坦的線性范圍為 0.006～4.0μg／ml，最低定量濃度為0.006μg／ml。

2.2.6 回收率和精密度實(shí)驗(yàn) 取空白血漿100μl，按2.2.3項(xiàng)下方法制備低、中、高3個(gè)濃度（厄貝沙坦片血漿濃度分別為0.015、0.2和3.2μg／ml）的質(zhì)控樣品，每一濃度進(jìn)行6樣本分析，連續(xù)測(cè)定3d，根據(jù)當(dāng)日的標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算質(zhì)控樣品的測(cè)得濃度。同時(shí)另取空白血漿100μl，除不加系列標(biāo)準(zhǔn)溶液和內(nèi)標(biāo)溶液外，向上清液中分別加入低、中、高3個(gè)濃度的質(zhì)控溶液50μl和內(nèi)標(biāo)溶液25μl，渦旋混合，按2.2.4項(xiàng)下操作，取10μl進(jìn)行LC－MS／MS分析，得相應(yīng)峰面積。以每一濃度兩種處理方法的峰面積比值計(jì)算方法回收率，分別為（92.2±3.5）%、（98.6±4.1）%和（93.8±4.9）%；根據(jù)質(zhì)控樣品結(jié)果計(jì)算得厄貝沙坦每一濃度水平的質(zhì)控樣品日內(nèi)RSD均＜4.5%，日間RSD均＜11.0%。

2.2.7 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 血漿樣品室溫放置2h后，經(jīng)沉淀蛋白質(zhì)處理后在室溫放置24h、經(jīng)歷3次冷凍－解凍循環(huán)、－20℃放置30d后穩(wěn)定，厄貝沙坦儲(chǔ)備液于4℃放置30d后穩(wěn)定。

2.2.8 基質(zhì)效應(yīng) 厄貝沙坦低、高濃度基質(zhì)效應(yīng)分別為106%和110%，且RSD均＜3.1%；內(nèi)標(biāo)基質(zhì)效應(yīng)為109%，RSD為5.2%。結(jié)果表明，在本研究選擇的色譜和質(zhì)譜條件下，可忽略基質(zhì)效應(yīng)的影響。

2.3 藥動(dòng)學(xué)參數(shù)和相對(duì)生物利用度 本研究所測(cè)得的血藥濃度數(shù)據(jù)用非房室模型進(jìn)行計(jì)算，cmax和tmax用實(shí)測(cè)值表示，AUC0～t用梯形法計(jì)算，AUC0～∞＝AUC0～t＋ctn／λz，tn是最后一次可實(shí)測(cè)濃度的取樣時(shí)間；ctn是末次可測(cè)定樣本藥物濃度；λz是對(duì)數(shù)血藥濃度－時(shí)間曲線末端直線部分求得的末端消除速率常數(shù)，可用對(duì)數(shù)血藥濃度－時(shí)間曲線末端直線部分的斜率求得；t1／2用公式t1／2＝0.693／λz計(jì)算。根據(jù)公式F＝AUCT／AUCR×100%計(jì)算受試制劑的相對(duì)生物利用度，結(jié)果見表1。受試制劑和參比制劑的平均血藥濃度－時(shí)間曲線見圖1。

表1 健康受試者單劑量口服0.15g厄貝沙坦后的主要藥動(dòng)學(xué)參數(shù)Table 1 Main pharmacokinetic parameters after a single oral dose of 0.15g test and reference irbesartan tablets in healthy volunteers（n＝24，）

表1 健康受試者單劑量口服0.15g厄貝沙坦后的主要藥動(dòng)學(xué)參數(shù)Table 1 Main pharmacokinetic parameters after a single oral dose of 0.15g test and reference irbesartan tablets in healthy volunteers（n＝24，）

組別 cmax（ρB／μg·ml－1） tmax（t／h） t1／2（t／h） AUC0～t（A／μg·h·ml－1）AUC0～∞（A／μg·h·ml－1） F（%）受試制劑 1.89±0.54 1.63±0.92 10.9±6.1 9.58±2.56 10.23±2.98 110.5±21.6參比制劑 1.99±0.46 1.52±0.83 11.4±7.7 8.90±2.87 9.56±2.93 100

圖1 健康受試者單劑量口服0.15g厄貝沙坦片后厄貝沙坦的平均血藥濃度－時(shí)間曲線Figure 1 Mean plasma concentration－time curves of irbesartan after a single oral dose of 0.15g irbesartan tablet in healthy volunteers

2.4 生物等效性評(píng)價(jià) 將受試制劑與參比制劑的AUC0～t和cmax經(jīng)對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)換后用方差分析、雙單側(cè)t檢驗(yàn)和90%置信區(qū)間法判斷。結(jié)果AUC0～t和cmax均拒絕生物不等效假設(shè)，受試制劑AUC0～t的90%置信區(qū)間為參比制劑相應(yīng)參數(shù)的102.4%～115.0%，cmax的90%置信區(qū)間為參比制劑相應(yīng)參數(shù)的86.3%～103.2%，tmax無(wú)顯著性差異（P＞0.05）。2.5 臨床觀察 單次口服0.15g受試制劑和參比制劑后，24例受試者均順利完成兩周期試驗(yàn)。3例因血壓下降引起短時(shí)間的頭暈、頭痛，1例咳嗽，程度均為輕度，經(jīng)研究者判定與試驗(yàn)藥物可能相關(guān)，未經(jīng)處置，均自行恢復(fù)，無(wú)嚴(yán)重不良事件發(fā)生。

3 討 論

本研究采用LC－MS／MS法測(cè)定健康人血漿中的厄貝沙坦?jié)舛龋?］，因乙腈質(zhì)譜響應(yīng)高于甲醇，故選擇乙腈為流動(dòng)相，同時(shí)加入少量甲酸（乙腈∶水∶甲酸為90∶10∶0.25）來(lái)提高待測(cè)物的離子化效率，避免了由于沉淀蛋白質(zhì)帶來(lái)的離子抑制。本方法具有準(zhǔn)確、選擇性強(qiáng)、靈敏度高的特點(diǎn)，適合于厄貝沙坦片的人體藥動(dòng)學(xué)和生物等效性研究。

所有受試者在給藥前后進(jìn)行的各項(xiàng)檢查數(shù)據(jù)均正?；虍惓o(wú)臨床意義，說(shuō)明單次給予試驗(yàn)藥物厄貝沙坦片安全性和耐受性良好。本研究所得厄貝沙坦的藥動(dòng)學(xué)參數(shù)與文獻(xiàn)報(bào)道［4，5］基本一致。方差分析、雙單側(cè)t檢驗(yàn)和90%置信區(qū)間分析結(jié)果表明，厄貝沙坦片受試制劑與參比制劑具有生物等效性。

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