慢性乙型肝炎患者外周血T 淋巴細(xì)胞程序性死亡受體1表達(dá)與HBV-DNA 水平的相關(guān)性

謝 巍，趙 川，王 容，王文平，涂 宏

（1）四川省遂寧市中心醫(yī)院消化內(nèi)科；2）心血管三病區(qū)，四川遂寧 629000）

慢性乙型肝炎（chronic hepatitis B，CHB）為臨床常見(jiàn)肝臟疾病，由乙型肝炎病毒（HBV）持續(xù)感染引起，調(diào)查顯示，我國(guó)CHB 患者人數(shù)為3 000萬(wàn)左右[1]。研究認(rèn)為，HBV 持續(xù)感染的原因與患者T 淋巴細(xì)胞功能低下有關(guān)[2]。相關(guān)資料指出，T 淋巴細(xì)胞數(shù)量和質(zhì)量上的缺陷會(huì)使HBV 難以有效清除，繼而導(dǎo)致疾病慢性化[3]。程序性死亡受體1（PD-1）是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的一種分子量為55KD 的單體I 型跨膜蛋白，為CD28 分子家族成員，可與程序性死亡配體1（PDL-1）結(jié)合，阻斷CD28 分子介導(dǎo)激活磷酸肌醇3 激酶途徑，繼而抑制T 淋巴細(xì)胞增殖與分化，減弱T 淋巴細(xì)胞功能[4-5]。隨著對(duì)細(xì)胞免疫學(xué)的深入研究，部分學(xué)者認(rèn)為CHB 的發(fā)生與發(fā)展可能與PD-1 有關(guān)[6]。本次研究以遂寧市中心醫(yī)院92 例CHB 患者為研究對(duì)象，分析CHB 患者外周血T 淋巴細(xì)胞PD-1 水平，并探討其與HBV-DNA 的相關(guān)性。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取遂寧市中心醫(yī)院2016 年1 月至2019 年3月收治的92 例CHB 患者為研究對(duì)象，均符合中華醫(yī)學(xué)會(huì)感染病學(xué)分會(huì)頒布的《慢性乙型肝炎防治指南》（2015 版）[7]中CHB 診斷標(biāo)準(zhǔn)，排除合并其他類(lèi)型肝炎病毒感染、自身免疫性肝病、酗酒史、血液系統(tǒng)疾病和人類(lèi)免疫缺陷病毒（HIV）感染者，且本次研究前6 個(gè)月未進(jìn)行過(guò)抗病毒和免疫治療，所有患者均自愿參與本次研究。92 例CHB 患者中男55 例，女37 例；年齡25～70 歲，平均（45.69±10.73）歲。另選擇60 例健康志愿者作為對(duì)照組，其中男36 例，女24 例；年齡22～64歲，平均（43.75±9.18）歲。

1.2 方法

外周血T 淋巴細(xì)胞PD-1 檢測(cè)：取兩組受檢者新鮮EDTA 抗凝全血，加入CD4-FTTC 或CD8-FTTC、PD-1-PE 或其相應(yīng)同型對(duì)照抗體（均由美國(guó)eBioscience 公司提供），于4℃環(huán)境中避光孵育20 min，之后加入500 μL 紅細(xì)胞裂解液（由美國(guó)BD 公司提供），再于4℃環(huán)境中避光孵育10 min，加入1 000 μL磷酸鹽緩沖溶液，以500×g 的轉(zhuǎn)速離心5 min，洗滌后使用流式細(xì)胞儀（由美國(guó)BD 公司提供）檢測(cè)。

HBV-DNA 水平檢測(cè)：采用熒光定量PCR 檢測(cè)，試劑盒由上海申友生物技術(shù)有限公司提供，PCR 儀由美國(guó)Applied Biosystems 公司提供，型號(hào)為ABI PRISM 7500 型。抽取患者外周靜脈血3 mL，以4 000 r/min 的速度離心5 min，置于-80℃環(huán)境中冷凍備用。取PCR 反應(yīng)管，將實(shí)驗(yàn)試劑與HBV 定量檢測(cè)試劑盒試劑置于室溫下解凍，之后將其混勻。取50 μL血漿標(biāo)本，加入等量DNA 提取液，混勻，將混合液置于100℃環(huán)境中靜置10 min，再在4℃環(huán)境中靜置10 h，待混合液完全裂解，以13 000 r/min 的速度離心5 min，吸取2 μL上清液，加入至PCR 反應(yīng)管，以6 000 r/min的速度離心30 s，取上清液置入PCR 基因擴(kuò)增儀，93℃環(huán)境中預(yù)變性2 min，30 s 變性，55℃1 min退火，反復(fù)40 次，擴(kuò)增儀擴(kuò)增后進(jìn)行結(jié)果宣讀。所有操作過(guò)程均嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，檢測(cè)下限為1×103IU/mL。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

觀(guān)察組和對(duì)照組外周血CD4+、CD8+T 淋巴細(xì)胞PD-1 表達(dá)情況比較觀(guān)察組外周血CD4+、CD8+T淋巴細(xì)胞PD-1 表達(dá)水平高于對(duì)照組（P＜0.05），見(jiàn)表1。

不同HBV-DNA 水平的CHB 患者外周血CD4+、CD8+T 淋巴細(xì)胞PD-1 表達(dá)情況比較92 例CHB 患者平均HBV-DNA 水平為（5.25±1.68）IgIU/mL，其中HBV-DNA 高水平組（＞6 IgIU/mL）34 例，HBV-DNA 中水平組（3～6 IgIU/mL）38例，HBV-DNA 低水平組（＜3 IgIU/mL）20 例。不同HBV-DNA 水平的CHB 患者外周血CD4+、CD8+T 淋巴細(xì)胞PD-1 表達(dá)水平均存在差異（P＜0.05），其中HBV-DNA 高水平組外周血CD4+、CD8+T 淋巴細(xì)胞PD-1 表達(dá)水平高于HBV-DNA 中水平組和HBV-DNA 低水平組，HBV-DNA 中水平組外周血CD4+、CD8+T 淋巴細(xì)胞PD-1 表達(dá)水平高于HBV-DNA 低水平組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見(jiàn)表2。

CHB 患者外周血CD4+、CD8+T 淋巴細(xì)胞PD-1表達(dá)水平與HBV-DNA 水平的相關(guān)性分析CHB 患者外周血CD4+、CD8+T 淋巴細(xì)胞PD-1 表達(dá)水平與HBV-DNA 水平均呈正相關(guān)（P＜0.05），見(jiàn)表3、圖1～2。

表1 觀(guān)察組和對(duì)照組外周血CD4+、CD8+T 淋巴細(xì)胞PD-1 表達(dá)情況比較（）Tab.1 Expressions of PD-1 in peripheral blood CD4+and CD8+T lymphocytes in the observation group and the control group（）

表1 觀(guān)察組和對(duì)照組外周血CD4+、CD8+T 淋巴細(xì)胞PD-1 表達(dá)情況比較（）Tab.1 Expressions of PD-1 in peripheral blood CD4+and CD8+T lymphocytes in the observation group and the control group（）

表2 不同HBV-DNA 水平的CHB 患者外周血CD4+、CD8+T 淋巴細(xì)胞PD-1 表達(dá)情況比較（）Tab.2 Expressions of PD-1 in peripheral blood CD4+and CD8+T lymphocytes in CHB patients with different HBV-DNA levels（）

表2 不同HBV-DNA 水平的CHB 患者外周血CD4+、CD8+T 淋巴細(xì)胞PD-1 表達(dá)情況比較（）Tab.2 Expressions of PD-1 in peripheral blood CD4+and CD8+T lymphocytes in CHB patients with different HBV-DNA levels（）

與HBV-DNA 低水平組比較，*P ＜0.05；與HBV-DNA 中水平組比較，#P ＜0.05。

表3 CHB 患者外周血CD4+、CD8+T 淋巴細(xì)胞PD-1 表達(dá)水平與HBV-DNA 水平的相關(guān)性分析Tab.3 The correlation between the expression levels of PD-1 in peripheral blood CD4+and CD8+T lymphocytes and HBV-DNA levels in patients with CHB

圖1 CHB 患者外周血CD4+T 淋巴細(xì)胞PD-1 表達(dá)水平與HBV-DNA 水平散點(diǎn)圖Fig.1 Scatter plot showing the expression level of PD-1 in peripheral blood CD4+ T lymphocytes and HBV-DNA level in patients with CHB

圖2 CHB 患者外周血CD8+T 淋巴細(xì)胞PD-1 表達(dá)水平與HBV-DNA 水平散點(diǎn)圖Fig.2 Scatter plot showing the expression level of PD-1 in peripheral blood CD8+ T lymphocytes and HBV-DNA level in patients with CHB

3 討論

HBV 為雙鏈DNA 病毒，其入侵人體后會(huì)受到宿主免疫系統(tǒng)防御作用，HBV 特異性T 淋巴細(xì)胞會(huì)殺滅受感染細(xì)胞，繼而抑制HBV-DNA 復(fù)制[8]。但由于個(gè)體對(duì)病毒免疫應(yīng)答存在差異，故而形成HBV 感染不同轉(zhuǎn)歸。CHB 是HBV 持續(xù)感染導(dǎo)致，其發(fā)生原因與機(jī)體免疫功能異常有關(guān)，T 淋巴細(xì)胞免疫功能狀態(tài)對(duì)HBV 清除程度起到重要作用。

PD-1 是在程序性死亡的T 淋巴細(xì)胞上發(fā)現(xiàn)的一種跨膜蛋白，可在活化的CD4+、CD8+T 淋巴細(xì)胞上進(jìn)行誘導(dǎo)性表達(dá)。相關(guān)研究表示，PD-1 可抑制T 淋巴細(xì)胞，并誘導(dǎo)免疫耐受，當(dāng)其與PDL-1結(jié)合后，會(huì)增強(qiáng)T 淋巴細(xì)胞線(xiàn)粒體內(nèi)氧化反應(yīng)，使得活性氧和過(guò)氧化氫水平升高，繼而抑制T 淋巴細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)其凋亡，削弱機(jī)體對(duì)病毒的免疫應(yīng)答，誘導(dǎo)免疫逃逸[9-10]。眾多研究顯示，在HIV、丙型肝炎病毒（HCV）等病毒慢性感染患者中，其PD-1 表達(dá)均明顯升高，而這與T 淋巴細(xì)胞功能受限相關(guān)[11-12]。肖健等[13]研究表明，HIV-1 感染患者外周血CD8+T 淋巴細(xì)胞PD-1 表達(dá)明顯高于健康人群，其認(rèn)為PD-1 高度表達(dá)與HIV 感染患者CD8+T細(xì)胞功能受到抑制和免疫耗竭有關(guān)。本次研究分析CHB 患者外周血CD4+、CD8+T 淋巴細(xì)胞PD-1 表達(dá)情況，顯示觀(guān)察組外周血CD4+、CD8+T 淋巴細(xì)胞PD-1 表達(dá)水平高于對(duì)照組（P＜0.05），表明CHB 患者外周血CD4+、CD8+T 淋巴細(xì)胞PD-1 表達(dá)增加。申紅玉等[14]研究也表明，慢性HBV 感染患者CD4+、CD8+T 淋巴細(xì)胞PD-1 表達(dá)水平過(guò)高。

分析不同HBV-DNA 水平的CHB 患者外周血CD4+、CD8+T 淋巴細(xì)胞PD-1 表達(dá)水平，顯示HBV-DNA 高水平組外周血CD4+、CD8+T 淋巴細(xì)胞PD-1 表達(dá)水平＞HBV-DNA 中水平組＞HBV-DNA低水平組（P＜0.05），提示CHB 患者外周血CD4+、CD8+T 淋巴細(xì)胞PD-1 表 達(dá) 水 平 與HBV-DNA 水平存在一定關(guān)聯(lián)性。進(jìn)一步行Pearson 相關(guān)性分析，發(fā)現(xiàn)CHB 患者外周血CD4+、CD8+T 淋巴細(xì)胞PD-1 表達(dá)水平與HBV-DNA 水平均呈正相關(guān)（r=0.527，r=0.568，P＜0.05）。分析原因，T 淋巴細(xì)胞增殖和分化受到PD-1/PDL-1通路的影響，水平下降，機(jī)體免疫防御機(jī)制越差，有利于HBV 復(fù)制，HBV-DNA 水平升高，且PD-1水平越高，T 淋巴細(xì)胞功能受限越嚴(yán)重，HBV 復(fù)制能力越強(qiáng)，HBV-DNA 水平越高。李志勤等[15]研究指出，對(duì)CHB 患者采用抗病毒治療，其治療后外周血CD8+T 淋巴細(xì)胞PD-1 表達(dá)水平明顯下降，這也為本次研究結(jié)果提供佐證。

實(shí)驗(yàn)證實(shí)，對(duì)HBV 感染小鼠予以PD-1 抗體或PDL-1 抗體來(lái)阻斷PD-1/PDL-1 通路，可增強(qiáng)抗病毒免疫作用[16-17]。相關(guān)研究表明，阻斷PD-1/PDL-1 通路可以促進(jìn)HIV-1 感染患者CD8+T淋巴細(xì)胞腫瘤壞死因子（TNF-α）和干擾素γ（INF-γ）分泌，而TNF-α 可促使被感染細(xì)胞凋亡，INF-γ 可進(jìn)行免疫調(diào)節(jié)，認(rèn)為PD-1 參與了CD8＋T 淋巴細(xì)胞功能抑制[13，18]?；趦煞N感染疾病PD-1 表達(dá)均過(guò)高，推測(cè)可通過(guò)阻斷PD-1/PDL-1通路來(lái)增強(qiáng)機(jī)體免疫功能，但由于本次研究條件有限，未能對(duì)此進(jìn)行探討，可將此點(diǎn)作為后期研究?jī)?nèi)容[19-20]。

綜上所述，CHB 患者外周血CD4＋、CD8＋T 淋巴細(xì)胞PD-1 表達(dá)增加，且會(huì)隨著HBV-DNA 水平的升高而升高。CHB 患者外周血CD4+、CD8+T 淋巴細(xì)胞PD-1 的過(guò)表達(dá)與T 淋巴細(xì)胞功能受限有關(guān)，可考慮阻斷PD-1/PDL-1 通路來(lái)恢復(fù)CD4+、CD8+T 淋巴細(xì)胞功能。