再生障礙性貧血患兒的環(huán)孢素群體藥動學(xué)研究

張雯雯，張 華，薛 領(lǐng)，杜 嬈，王 誠，繆麗燕＊

（1.蘇州大學(xué)附屬第一醫(yī)院藥學(xué)部，蘇州215006；2.蘇州大學(xué)附屬兒童醫(yī)院藥劑科，蘇州215003）

［本文編輯］蘭 芬

再生障礙性貧血（簡稱再障）是一種骨髓造血功能衰竭和外周血全血細胞減少性疾病。免疫抑制治療是治療再障的主要手段，臨床上常用環(huán)孢素（cyclosporine，CsA）和雄性激素聯(lián)合治療，重癥再障一般選擇CsA聯(lián)合抗淋巴細胞／抗胸腺細胞球蛋白治療。CsA是一種鈣調(diào)磷酸酶類免疫抑制劑，治療窗窄，毒副作用大，其藥動學(xué)存在較大的個體差異。目前，臨床上主要通過監(jiān)測CsA的血藥濃度進行劑量調(diào)整，以確保用藥安全和有效。影響CsA藥動學(xué)的因素主要包括病人的人口學(xué)特征、病理生理狀態(tài)、移植后時間、合并用藥情況和遺傳因素等。群體藥動學(xué)能定量考察以上協(xié)變量對CsA在病人體內(nèi)藥動學(xué)過程的影響。目前，關(guān)于CsA的群體藥動學(xué)研究主要集中在實體器官移植成年病人群體，國內(nèi)外對于兒童病人的群體藥動學(xué)研究較少［1，2］，尤其是CsA在再障患兒的群體藥動學(xué)研究尚未見報道。影響患兒藥動學(xué)的因素與成人相比可能存在差異，因此有必要依據(jù)再障的疾病特征對患兒進行群體藥動學(xué)研究。本研究收集再障患兒的CsA血藥濃度監(jiān)測數(shù)據(jù)，建立該群體的藥動學(xué)模型，以期為再障患兒個體化使用CsA提供參考。

1 材料和方法

1.1 病例資料 收集94例再障患兒常規(guī)監(jiān)測的194個CsA血藥濃度。患兒入組標準為：年齡0～16歲，患有再障，入院后初次使用CsA。查閱患兒的病史，收集以下信息：（1）給藥信息：CsA的給藥劑量、給藥途徑、給藥時間和采血時間；（2）人口學(xué)特征：包括年齡、性別和體重；（3）血常規(guī)指標：紅細胞計數(shù)、血紅蛋白濃度和紅細胞比積；（4）生化指標：總膽紅素、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST）、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）、總蛋白質(zhì)、肌酐、尿素和尿酸等；（5）合并用藥情況：是否合用激素類藥物、抗真菌藥等。

1.2 血樣采集和濃度測定 根據(jù)臨床需要，患兒初次口服CsA 給藥劑量為5～8mg·kg－1·d－1，q12h，前3個月維持血藥濃度100～300ng／ml，3個月之后維持血藥濃度100～200ng／ml。患兒在住院期間開始服用CsA后，每隔7～21d或更長時間，于早晨服藥前采外周靜脈血測定CsA濃度（c0）。采用熒光偏振免疫分析法（fluorescence polarization immunoassay，F(xiàn)PIA）在TDx儀器（美國Abbott公司）上測定CsA的全血濃度。

1.3 基因型檢測 收集94例患兒的外周血樣本，使用DNA提取試劑盒（美國Promega公司）提取DNA，保存于－80℃冰箱中備用。使用限制性內(nèi)切酶片段長度多態(tài)性（RFLP）方法測定CYP3A5 A6986G 和 CYP3A4G82266A 基因型［3，4］。

1.4 群體藥動學(xué)模型的建立 使用NONMEM軟件（7.2.0版，雙精度）對數(shù)據(jù)進行分析，采用一級條件估計及交互作用（first order conditional estimation with interaction，F(xiàn)OCE－Ⅰ ）算 法，調(diào) 用ADVAN2TRANS2子程序估算CsA的群體藥動學(xué)參數(shù)。

1.4.1 基礎(chǔ)藥動學(xué)模型 對94例患兒的血藥濃度數(shù)據(jù)分別用單室模型和雙室模型進行評價，結(jié)果發(fā)現(xiàn)雙室模型的擬合度與單室模型相比并無明顯優(yōu)勢，最終選擇一級吸收、一級消除的單室模型為基礎(chǔ)藥動學(xué)模型。

1.4.2 統(tǒng)計學(xué)模型 將個體間變異模型和個體內(nèi)變異模型分別用加法模型、指數(shù)模型、比例模型及其組合模型擬合比較，選擇目標函數(shù)值（OFV）最小、個體變異小、估算參數(shù)合理的模型為最終統(tǒng)計學(xué)模型。本研究中個體間變異選擇指數(shù)模型θi＝θ×exp（ηi）表示，式中θi為第i個受試者的藥動學(xué)參數(shù)（CL、V、Ka）；θ為群體典型值；ηi為個體間變異，服從均值為0，方差為ω2的正態(tài)分布。個體內(nèi)變異選擇比例模型和加法模型的混合模型cij＝cpredij×（1＋εij1）＋εij2表示，式中cij為血藥濃度檢測值，cpredij為模型預(yù)測值，εij1和εij2是殘余誤差，服從均值為0，方差分別為σ12和σ22的正態(tài)分布。

1.4.3 固定效應(yīng)模型 將所選取的協(xié)變量分別以加法模型、乘冪模型或指數(shù)模型逐一引入到基礎(chǔ)藥動學(xué)模型中。引入?yún)f(xié)變量的模型與基礎(chǔ)藥動學(xué)模型的目標函數(shù)值差值（△OFV）服從F分布，近似服從χ2分布。初步篩選過程中定顯著性水平α＝0.05，自由度df＝1。若△OFV＞3.84則有顯著性差異，保留此協(xié)變量，初步篩選出對CsA藥動學(xué)參數(shù)有影響的協(xié)變量。然后通過有序遞加法將初步篩選出的協(xié)變量按照△OFV從大到小的順序依次加入到基礎(chǔ)藥動學(xué)模型中，定顯著性水平為α＝0.01，自由度df＝1。若△OFV＞6.64，則引入該協(xié)變量，建立全量回歸模型。最后通過向后剔除法逐一剔除全量回歸模型中的協(xié)變量。若△OFV＞10.83（P＜0.001），則保留該協(xié)變量，否則將其剔除，得到最終模型。

1.5 模型驗證 采用自舉法（Bootstrap）對模型進行內(nèi)部驗證，以評價最終模型的穩(wěn)定性和準確度。本研究利用Wings for NONMEM程序，重復(fù)采樣1 000次，計算自舉1 000次的群體藥動學(xué)參數(shù)的中位數(shù)及2.5%和97.5%百分位數(shù)，驗證最終模型的穩(wěn)定性。

2 結(jié) 果

2.1 基本資料 收集94例患兒的基本資料：年齡（7±3）歲，男性49例，女性45例，體重（27.3±12.6）kg，紅細胞（2.5±0.5）1012／L，血紅蛋白（79±16）g／L，紅細胞比積（0.23±0.05）%，總膽紅素（10.3±5.8）μmol／L，AST（25.9±22.6）U／L，ALT（29.2 ± 57.2）U／L，肌 酐（34.0 ±12.4）μmol／L，尿酸（209.4±74.7）μmol／L，尿素（5.98 ± 2.17）mmol／L，總蛋白質(zhì)（65.6±6.9）g／L。CYP3A4＊1／＊1基因型有52例（55%），CYP3A4＊1／＊18B基因型有40例（43%），CYP3A4＊18B／＊18B基因型有2例（2%），CYP＊1／＊1基因型有6例（6%），CYP＊1／＊3基因型有31例（33%），CYP＊3／＊3基因型有57例（61%），符 合 Hardy－Weinberg平 衡。CYP3A5＊3 和CYP3A4＊18B等位基因發(fā)生突變的頻率分別為0.77和0.23。

2.2 最終群體藥動學(xué)模型 由于采樣時間集中于給藥前，為谷濃度點，無吸收相數(shù)據(jù)，故根據(jù)文獻報道固定Ka值為0.83／h［1］。本研究經(jīng)過篩選協(xié)變量，發(fā)現(xiàn)除年齡以外的其他協(xié)變量對藥動學(xué)參數(shù)無影響，確定最終群體藥動學(xué)模型為：CL＝29.5×（AGE／7）0.339×exp（ηCL）。式中 AGE為年齡，ηCL是均數(shù)為0、方差為ω2的個體間變異。最終模型中，年齡是影響表觀清除率（CL／F）的主要協(xié)變量，生化指標、血常規(guī)指標、合并用藥和代謝酶基因多態(tài)性等其他因素對CsA藥動學(xué)參數(shù)的影響無統(tǒng)計學(xué)意義。最終模型與基礎(chǔ)模型相比，OFV下降了20.7，表觀清除率的個體間變異由31.9%下降到27.8%，表觀分布容積的個體間變異為0.14%，個體內(nèi)變異為36.4%和70ng／ml?；A(chǔ)模型和最終模型的群體藥動學(xué)參數(shù)以及自舉法驗證結(jié)果見表1。

2.3 模型的評價和驗證 CsA濃度檢測值與模型群體預(yù)測值、模型個體預(yù)測值的散點圖見圖1。從圖1可見，預(yù)測值與檢測值均較均勻地分散在對角線兩側(cè)。加權(quán)殘差（WRES）位于－2.06～4.41范圍內(nèi)，加權(quán)殘差與最終模型群體預(yù)測值、個體預(yù)測值散點圖見圖2。由表1可見，最終模型參數(shù)與1 000次自舉法所得參數(shù)中位數(shù)比較無明顯差異，最終模型參數(shù)值在自舉法結(jié)果的2.5%和97.5%百分位數(shù)間，證明確立的最終模型較穩(wěn)定。

3 討 論

3.1 CsA的群體藥動學(xué)參數(shù) 本研究回顧性收集了再障患兒常規(guī)CsA血藥濃度監(jiān)測數(shù)據(jù)和相關(guān)資料，運用NONMEM軟件進行統(tǒng)計分析，建立該類病人的群體藥動學(xué)模型。最終模型所估算的群體表觀清除率（CL／F）和表觀分布容積（V／F）分別為29.5L／h和419L。表觀清除率估計值與成人實體器官移植病人的檢測值相近，而表觀分布容積的估計值則大于成人實體器官移植病人的檢測值［5，6］?？赡苡捎谠僬喜∪溯^腎移植病人的紅細胞數(shù)偏低，而CsA在血液中與紅細胞廣泛結(jié)合，紅細胞數(shù)低導(dǎo)致游離CsA濃度高，分布容積大［7］。另一原因可能是兒童的脂蛋白水平比成年人更低，則血漿蛋白結(jié)合率低，從而導(dǎo)致游離CsA濃度升高，分布容積增大［7］。本研究根據(jù)最終模型藥動學(xué)參數(shù)得到CsA半衰期（t1／2）為9.8h，與 CsA 在兒童體內(nèi)的t1／2為7～19h相一致。

表1 環(huán)孢素群體藥動學(xué)參數(shù)估計及自舉法驗證結(jié)果Table 1 Estimates and bootstrap validation results of population pharmacokinetic parameters of cyclosporine（n＝94）

圖1 最終模型環(huán)孢素血藥濃度檢測值與群體預(yù)測值、個體預(yù)測值的散點圖Figure 1 Scatter plots of tested concentrations versus population predicted concentrations and individual predicted concentrations of cyclosporine in the final model

3.2 年齡對CsA清除率的影響 最終模型顯示，隨著年齡的增長，再障患兒CsA的表觀清除率增加，提示臨床兒童使用CsA需考慮年齡因素的影響，分析原因可能是兒童生長發(fā)育過程中機體功能的改變導(dǎo)致表觀清除率呈現(xiàn)年齡依賴性。在本研究初步篩選中，體重對表觀清除率有顯著影響，但是在逐步篩選過程中被剔除，可能由于年齡和體重存在共線性（r2＝0.702 1）。

3.3 基因多態(tài)性對CsA清除率的影響 肝藥酶CYP3A5和CYP3A4基因多態(tài)性對CsA的體內(nèi)代謝無影響，可能是由于兒童生長發(fā)育過程中酶活性的差異是影響藥物體內(nèi)代謝更主要的因素。CsA主要是由CYP3A代謝，CYP3A主要包括CYP3A4和CYP3A5。CYP3A5＊3突變導(dǎo)致CYP3A5不表達，可能會導(dǎo)致CsA的代謝差異。中國人群中CYP3A4＊18B突變可能與酶活性水平升高有關(guān)［4］。在本研究中，代謝酶基因多態(tài)性對CsA的藥動學(xué)參數(shù)沒有影響，此結(jié)果與Fanta等［2］和Turolo等［8］對腎移植兒童的研究結(jié)果一致。對成人實體器官和干細胞移植病人的研究報道有相似或者相反的結(jié)論［9，10］。兒童生長發(fā)育過程中代謝酶活性的差異可能導(dǎo)致代謝酶基因多態(tài)性對CsA藥動學(xué)參數(shù)無影 響。Stevens 等［11］研究發(fā)現(xiàn)，兒童出生后CYP3A4蛋白水平逐漸增加，并且5～15歲兒童的CYP3A4蛋白表達水平低于成人；CYP3A5mRNA水平與年齡無相關(guān)性。Fakhoury等［12］研究發(fā)現(xiàn)，1歲兒童CYP3A4、CYP3A5mRNA水平最高，從1～17歲隨著年齡增長而降低。由此也可推斷，生長發(fā)育過程中CYP3A酶表達和功能的變化可能也是CsA表觀清除率發(fā)生年齡依賴性變化的一個重要原因?？傊x酶多態(tài)性對患兒CsA濃度的影響報道較少，尚需要進一步研究確證。

由于回顧性研究的采樣時間點有局限，所以數(shù)據(jù)稀疏，本研究對CsA在再障患兒中的群體藥動學(xué)只做了初步分析，有待大樣本數(shù)據(jù)的確證。本研究發(fā)現(xiàn)，年齡是影響再障患兒體內(nèi)CsA代謝差異的一個主要因素，CsA表觀清除率隨著年齡的增長而增大。本研究結(jié)果可為再障患兒個體化使用CsA提供臨床依據(jù)。

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