HPLC法測(cè)定香桂化濁膠囊中大黃素的含量Δ

劉紅淼，楊繼章，李艷玲（1.河北醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院，石家莊050031；.石藥集團(tuán)中奇制藥技術(shù)（石家莊）有限公司，石家莊 050051）

香桂化濁方為河北醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院臨床應(yīng)用多年的經(jīng)驗(yàn)方，由廣藿香、土大黃、肉桂等藥材組成。其療效確切、可靠，具有芳香醒脾、清化濕濁之功，主治因各種疾病后邪留未盡、脾胃內(nèi)傷所致長(zhǎng)期大便溏泄或有黏液、腹脹腸鳴、納呆，低熱，舌苔白膩或白滑或見(jiàn)微黃，脈濡緩；主要用于慢性腸炎、真菌感染致腸炎證屬脾虛濕困的治療。關(guān)于本方制劑工藝及質(zhì)量控制方法的研究已有報(bào)道[1～4]。為了更加全面、有效地控制其質(zhì)量，筆者采用高效液相色譜（HPLC）法對(duì)香桂化濁膠囊中土大黃中大黃素的含量進(jìn)行了測(cè)定。

1 儀器與試藥

LC-10 A系列HPLC儀，包括LC-10 Avp高壓泵、SPD-10 Avp紫外檢測(cè)器、SCL-10 Avp系統(tǒng)控制器及Class-vp 6.10色譜工作站（日本島津公司）；電子天平（德國(guó)Sartorius公司）。

香桂化濁膠囊（批號(hào)：20100601、20100602、20100603）和陰性樣品均為河北醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院制劑室制備；大黃素對(duì)照品（中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：110756-200110，供含量測(cè)定用）；甲醇、乙腈為色譜純，其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果[5，6]

2.1 色譜條件

色譜柱：Hypersil C18（150 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：0.1 mol·L－1磷酸二氫鈉溶液（用磷酸調(diào)pH值至3.0）-甲醇-乙腈（30∶35∶35）；流速：1.2 mL·min－1；進(jìn)樣量：20 μL；檢測(cè)波長(zhǎng)：289 nm。

2.2 對(duì)照品溶液的制備

精密稱取大黃素對(duì)照品10.04 mg，置200 mL量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.3 供試品溶液的制備

取膠囊內(nèi)容物，精密稱取約0.6 g，置100 mL圓底燒瓶中，加0.5mol·L－1鹽酸30mL，（80±5）℃水浴2h，放至室溫，過(guò)濾，濾液用氯仿（20、20、20、10、10 mL）萃取5次，合并萃取液，備用。濾渣晾干，置索氏提取器中，用氯仿提至無(wú)色（提取約4.5 h）。與上述萃取液合并，蒸除氯仿，揮干，殘?jiān)蛹状既芙獠⑥D(zhuǎn)移至25 mL量瓶中，定容，搖勻，用0.45 μm微孔濾膜濾過(guò)，即得。

2.4 專屬性試驗(yàn)

取不含土大黃的陰性樣品，按“2.3”項(xiàng)下方法制備陰性對(duì)照溶液。取對(duì)照品溶液、供試品溶液、陰性對(duì)照溶液各適量，按上述色譜條件進(jìn)樣測(cè)定。結(jié)果表明，陰性對(duì)照在大黃素保留時(shí)間處無(wú)干擾峰出現(xiàn)。色譜見(jiàn)圖1。

2.5 線性關(guān)系考察

圖1 高效液相色譜圖Fig 1 HPLC chromatograms

精密量取大黃素對(duì)照品溶液0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL，分別置于10 mL量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，得系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別精密量取20 μL，注入HPLC儀，記錄色譜圖，測(cè)定峰面積。以峰面積積分值（Y）對(duì)對(duì)照品濃度（X）進(jìn)行線性回歸，得回歸方程為Y＝6.813×104X－1.456×103（r＝0.9999，n＝6）。結(jié)果表明，大黃素的檢測(cè)濃度在2.51～25.10 μg·mL－1范圍內(nèi)與峰面積積分值呈良好線性關(guān)系。

2.6 精密度試驗(yàn)

精密量取同一份對(duì)照品溶液（15.6 μg·mL－1）20 μL，連續(xù)進(jìn)樣5次，記錄峰面積。結(jié)果，RSD＝0.65%（n＝5），表明儀器精密度良好。

2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取同一份供試品溶液，分別于0、2、4、8、12 h進(jìn)樣測(cè)定，每次20 μL。結(jié)果，RSD＝0.73%（n＝5），表明供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.8 重復(fù)性試驗(yàn)

取同一批（批號(hào)：20100602）樣品適量，按“2.3”項(xiàng)下方法平行制備6份供試品溶液，用甲醇轉(zhuǎn)移至25mL量瓶中，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜濾過(guò)，取續(xù)濾液20 μL，注入HPLC儀，測(cè)定大黃素含量。結(jié)果，樣品平均含量為 0.3973mg·g－1，RSD＝1.41%（n＝6），表明該方法重復(fù)性良好。

2.9 加樣回收率試驗(yàn)

取已知大黃素含量的香桂化濁膠囊樣品（批號(hào)：20100602）約0.39 g，精密稱定9份，分別精密加入不同量的大黃素對(duì)照品溶液，照“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液并測(cè)定含量，計(jì)算加樣回收率，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果（n＝9）Tab 1 Results of recovery test（n＝9）

2.10 樣品含量測(cè)定

取3批樣品（批號(hào)：20100601、20100602、20100603）各適量，分別按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，照上述方法測(cè)定大黃素的含量。結(jié)果，3批樣品中大黃素含量分別為0.3941、0.4351、0.3997 mg·g－1。根據(jù)此結(jié)果，同時(shí)考慮藥材來(lái)源及制劑生產(chǎn)、貯藏等因素，暫定大黃素含量限度為不得少于0.30 mg·g－1。

3 討論

根據(jù)大黃素的理化性質(zhì)，筆者分別采用3種方法提取同一批樣品中的大黃素：（1）超聲提取法：樣品加50 mL甲醇超聲30 min，放冷，過(guò)濾，濾液加30 mL 0.5 mol·L－1的鹽酸，（80±5）℃水浴水解2 h，放至室溫，用氯仿（20、20、20、10、10 mL）萃取至無(wú)色，合并萃取液，揮干氯仿，殘?jiān)蛹状既芙獠⑥D(zhuǎn)移至25 mL量瓶中，定容，搖勻，用0.45 μm微孔濾膜濾過(guò)，即得。（2）水解、提取同時(shí)進(jìn)行法：樣品加0.5 mol·L－1的鹽酸30 mL、氯仿30 mL，置（80±5）℃水浴上回流2 h，放至室溫，分取氯仿層，水層分別用氯仿（20、20、20、10、10 mL）萃取至無(wú)色，合并氯仿層，蒸除氯仿，殘?jiān)蛹状既芙獠⑥D(zhuǎn)移至25 mL量瓶中，定容，搖勻，用0.45 μm微孔濾膜濾過(guò)，即得。（3）索氏提取法：將膠囊內(nèi)容物置100 mL圓底燒瓶中，加入0.5 mol·L－1的鹽酸30 mL，置（80±5）℃水浴上水解2h，放至室溫，過(guò)濾，濾液用氯仿（20、20、20、10、10 mL）萃取5次，合并萃取液，備用；濾渣陰干，置索氏提取器中用氯仿提至無(wú)色（約4.5 h），再與上述萃取液合并，蒸除氯仿，揮干，殘?jiān)蛹状既芙獠⑥D(zhuǎn)移至25 mL量瓶中，定容，搖勻，用0.45 μm濾膜濾過(guò)，即得。通過(guò)測(cè)定3種方法所提樣品中的大黃素含量，結(jié)果表明，方法（2）的色譜圖上，雜質(zhì)峰與大黃素峰難以分離，不能定量；方法（1）的色譜圖上供試品雜質(zhì)峰多，且在過(guò)濾過(guò)程中易造成不平行操作；而采用方法（3），大黃素提取較完全且雜質(zhì)峰少、分離效果好、穩(wěn)定，故采用方法（3）——索氏提取法提取大黃素。

綜上，本方法操作簡(jiǎn)便，靈敏性、準(zhǔn)確性、重復(fù)性好，可用于香桂化濁膠囊的質(zhì)量控制。

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