瘤內(nèi)注射用姜黃素溫敏凝膠的處方篩選及pH值的確定

高萌，張成鴻，鮑旭，蔣妮，何艷，田舸，田燕#（.大連醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，遼寧大連6044；.大連醫(yī)科大學(xué)形態(tài)學(xué)實(shí)驗(yàn)室，遼寧大連 6044；.大連兒童醫(yī)院藥劑科，遼寧大連 600）

經(jīng)皮無(wú)水乙醇注射療法（percutaneous ethanol injection therapy，PEIT）是一種應(yīng)用廣泛、療效肯定的瘤內(nèi)注射療法，尤其對(duì)于腫瘤直徑≤3 cm的肝癌有很好的治療效果。但乙醇會(huì)從針孔外漏到肝包膜外而引起劇烈疼痛，或經(jīng)小血管進(jìn)入循環(huán)系統(tǒng)引起不良反應(yīng)，對(duì)肝組織的毒性較大，不適于肝功能差的患者。據(jù)文獻(xiàn)[1]報(bào)道，若將藥物制備成溫度敏感型原位凝膠（以下簡(jiǎn)稱溫敏凝膠）并采用瘤內(nèi)注射的給藥方式，既可以避開(kāi)首關(guān)效應(yīng)以及在消化道和胃腸道中的降解，減輕化療藥物的不良反應(yīng)，又克服了瘤內(nèi)注射液體制劑易擴(kuò)散的缺點(diǎn)，達(dá)到靶向給藥和延緩藥物釋放的目的。因此，筆者選擇藥用輔料泊洛沙姆為基質(zhì)制備瘤內(nèi)注射用姜黃素溫敏凝膠，在彌補(bǔ)PEIT不足的前提下，達(dá)到更好的治療效果。

溫敏凝膠在貯藏條件（4℃）下是自由流動(dòng)的液體，進(jìn)入體內(nèi)后可在注射部位發(fā)生相轉(zhuǎn)變形成半固體狀態(tài)凝膠，能達(dá)到局部給藥或延緩藥物釋放的目的[2]。其中，用泊洛沙姆407（P407）制備的凝膠表面光滑柔軟，在注射部位沒(méi)有明顯的異物感、無(wú)毒無(wú)刺激、生物相容性好[3]，是常用的制備溫敏凝膠的輔料。姜黃素（Curcumin）是中藥姜黃中的有效成分，具有抗腫瘤、抗炎、抗氧化、抗菌、保肝等多種藥理活性[4]，是一種高效低毒的天然抗癌藥物，對(duì)小鼠腹水型肝癌高淋巴道轉(zhuǎn)移細(xì)胞株有很強(qiáng)的抑制作用[5]。有關(guān)姜黃素制劑的報(bào)道較少，其主要原因是姜黃素水溶性差、不穩(wěn)定且易降解[6]，故體內(nèi)吸收差。筆者選擇P407、P188為基質(zhì)，聚乙二醇400（PEG400）、1，2-丙二醇、磷酸鹽緩沖液為溶劑，通過(guò)正交試驗(yàn)篩選姜黃素溫敏凝膠的最佳處方，通過(guò)穩(wěn)定性試驗(yàn)確定其最適宜pH值，從而提高姜黃素的穩(wěn)定性，為制備姜黃素制劑提供試驗(yàn)依據(jù)，使其具有更好的開(kāi)發(fā)和應(yīng)用前景。

1 儀器與試藥

1100型高效液相色譜（HPLC）儀（美國(guó)安捷倫公司）；Krom Asil C18柱（大連江申分離科學(xué)技術(shù)公司）；NDJ-7旋轉(zhuǎn)式黏度計(jì)、FA1104萬(wàn)分之一電子天平（0.1 mg），均購(gòu)于上海精密科學(xué)儀器有限公司；501超級(jí)恒溫器（上海市實(shí)驗(yàn)儀器廠）；79-1磁力加熱攪拌器（金壇市醫(yī)療儀器廠）；PB-20標(biāo)準(zhǔn)型pH計(jì)（北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司）。

姜黃素原料藥（陜西森弗生物技術(shù)有限公司，純度：95%，批號(hào)：20101213）；姜黃素標(biāo)準(zhǔn)品（成都曼思特生物科技有限公司，純度：98%，批號(hào)：20110302）；P407（批號(hào)：119 K0073）、P188（批號(hào)：129 K0055），均購(gòu)于美國(guó)Sigma公司；PEG400（分析純，天津市福晨化學(xué)試劑廠，批號(hào)：20080701）；1，2-丙二醇（分析純，天津市化學(xué)試劑一廠，批號(hào)：990428）；乙腈（色譜純，美國(guó)Tedia公司，批號(hào)：1009262）；冰醋酸（色譜純，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)：20090706）；姜黃素溫敏凝膠（大連醫(yī)科大學(xué)藥劑學(xué)教研室自制，批號(hào)：20110301、20110302、20110303，規(guī)格：2 mg·mL－1）。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件[7]

色譜柱：以十八烷基硅烷鍵合硅膠為黏合劑的Krom AsilC18柱（150mm×4.6mm，5μm）；流動(dòng)相：乙腈-2%冰醋酸（58∶42）；檢測(cè)波長(zhǎng)：430 nm；流速：1 mL·min－1；柱溫：室溫；進(jìn)樣量：20 μL。理論板數(shù)按姜黃素峰計(jì)算應(yīng)不低于4000。精密量取姜黃素標(biāo)準(zhǔn)品5 mg和姜黃素溫敏凝膠適量（含姜黃素約5 mg），分別置50 mL量瓶中，用流動(dòng)相溶解并稀釋至刻度，按上述色譜條件分別進(jìn)樣。結(jié)果，姜黃素保留時(shí)間在7.7 min左右，分離度符合要求。色譜見(jiàn)圖1。

2.2 姜黃素溫敏凝膠的處方篩選

2.2.1 姜黃素溫敏凝膠的制備[8，9]分別稱取處方量P407、P188，加入60 mL磷酸鹽緩沖液溶解，在4℃冰箱中放置至溶液澄明，為A液。精密稱定處方量姜黃素，溶于處方量PEG400和1，2-丙二醇中，超聲至完全溶解，為B液。將B液完全轉(zhuǎn)移至A液中，所得溶液為C液，在C液中加入磷酸鹽緩沖液至100 mL，在4℃放置至C液完全澄清，調(diào)節(jié)至所需pH值，即得（規(guī)格：2 mg·mL－1）。

2.2.2 膠凝溫度的測(cè)定[10]采用攪拌子法，在西林瓶中裝入溫敏凝膠溶液10mL和攪拌子，插入精度為0.1℃的精密溫度計(jì)，溫度計(jì)的水銀球完全浸沒(méi)在凝膠溶液中。將其放入低溫（10℃）水浴中，保持水浴持續(xù)緩慢升溫，使凝膠的溫度上升速率約為（1～2）℃·min－1。將磁力攪拌子完全停止轉(zhuǎn)動(dòng)的溫度定義為膠凝溫度。

2.2.3 黏度的測(cè)定[9]取凝膠樣品溶液15 mL置樣品管中，用循環(huán)水浴使其升溫至40℃以上，再以（1～2）℃·min－1的速率緩慢冷卻至10℃，選擇合適量程的懸吊式轉(zhuǎn)子測(cè)定不同溫度下的黏度，從40℃開(kāi)始，溫度每下降1℃記錄一個(gè)黏度值。

2.2.4 姜黃素的最大溶解度 精密量取不同配比的1，2-丙二醇、PEG400適量，置燒杯中，磷酸鹽緩沖液加至100 mL，在超聲溶解狀態(tài)下，用減量法逐漸加入適量姜黃素至最大飽和為度（10～15 min內(nèi)不再溶解為準(zhǔn)），平行制備5個(gè)樣品，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定含量，求出平均值，結(jié)果見(jiàn)表1。

結(jié)果表明，姜黃素在10%PEG400、14%1，2-丙二醇中的溶解度最大，即（2.447±0.121）mg·mL－1，大大提高了姜黃素的溶解度。

表1 姜黃素的最大溶解度測(cè)定結(jié)果（±s，n＝5）Tab 1 Maximum dissolution rate of curcumin（±s，n＝5）

表1 姜黃素的最大溶解度測(cè)定結(jié)果（±s，n＝5）Tab 1 Maximum dissolution rate of curcumin（±s，n＝5）

PEG400/%6810810610861，2-丙二醇/%101214141012121410最大溶解度/mg·mL-11.605±0.1052.026±0.0032.447±0.1212.197±0.1182.105±0.0081.776±0.1072.276±0.1312.197±0.0061.605±0.145

2.2.5 含藥量的測(cè)定 精密稱取姜黃素標(biāo)準(zhǔn)品5 mg，置于25 mL量瓶中，甲醇稀釋至刻度，得濃度為0.2 mg·mL－1的標(biāo)準(zhǔn)品貯備液，精密量取姜黃素標(biāo)準(zhǔn)品貯備液200、400、800、1600、3200、6400 μL，置于10 mL量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，配成濃度分別為4、8、16、32、64、128μg·mL－1的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液。按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，平行測(cè)定3次，每次進(jìn)樣量20 μ L。以峰面積積分值（A）為縱坐標(biāo)，姜黃素檢測(cè)濃度（c）為橫坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，得回歸方程為A＝113.2 c+82.177（r＝0.9993）。精密量取200μL姜黃素溫敏凝膠置10 mL量瓶中，甲醇定容?；靹蚝蟀瓷戏y(cè)定，根據(jù)回歸方程計(jì)算姜黃素溫敏凝膠中姜黃素的含量。

2.2.6 正交試驗(yàn)優(yōu)選處方 通過(guò)預(yù)試驗(yàn)中單因素試驗(yàn)結(jié)果，選擇P407的濃度（A）、P188的濃度（B）、PEG 400的濃度（C）、1，2-丙二醇的濃度（D）為考察因素，以膠凝溫度（T）、黏度（η）和含藥量的綜合評(píng)分為評(píng)價(jià)指標(biāo)（評(píng)分方法：（1）T：由于人體的正常體溫范圍為36～37℃，故膠凝溫度在此范圍內(nèi)者得100分，每低于36℃或高于37℃為1℃者扣5分，若轉(zhuǎn)子無(wú)停止則記為0分。（2）η：以正交試驗(yàn)結(jié)果中膠凝溫度時(shí)的黏度為標(biāo)準(zhǔn)，＜10 mPa·s者為100分，10～20 mPa·s者為90分，20～30 mPa·s者為80分，30～40 mPa·s者為70分。（3）含藥量：以正交試驗(yàn)結(jié)果中含量最高者為滿分100分，每低于此含量0.1 mg者扣5分。（4）綜合評(píng)分：綜合評(píng)分＝膠凝溫度記分×50%+黏度記分×20%+含量記分×30%）。采用L9（34）正交表安排試驗(yàn)，測(cè)定評(píng)價(jià)指標(biāo)，計(jì)算每次試驗(yàn)得分確定最佳配比，每個(gè)試驗(yàn)重復(fù)3次。用SPSS 11.5統(tǒng)計(jì)軟件，多組資料采用方差分析，兩組間比較采用t檢驗(yàn)。因素水平見(jiàn)表2；正交試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表3；方差分析結(jié)果見(jiàn)表4。

由表3、表4可知，4種因素對(duì)工藝均有顯著性影響（P＜0.05或P＜0.01），其影響大小為A＞C＞D＞B，即P407濃度為影響姜黃素溫敏凝膠性質(zhì)的主要因素，其次是PEG400濃度，再次為1，2-丙二醇濃度，最后是P188濃度。較好的組合為A2B2C2D2，即P407濃度為20%、P188濃度為4%、PEG400的濃度為8%、1，2-丙二醇的濃度為12%。

2.3 姜黃素溫敏凝膠最適宜pH值的確定

2.3.1 不同pH值下姜黃素溫敏凝膠的標(biāo)準(zhǔn)曲線 配制pH值分別為5.5、6.0、6.5、7.0、7.5的磷酸鹽緩沖溶液，按“2.2.6”項(xiàng)下最終確定的處方量制備不同pH值的姜黃素溫敏凝膠。待凝膠充分混勻溶解之后，用pH計(jì)調(diào)pH值為6.0、6.5、7.0、7.5、8.0，為不同pH值下的姜黃素的貯備液。精密量取各姜黃素貯備液0.5、1.0、2.0、4.0、8.0 mL，置于100 mL量瓶中，用甲醇定容，混勻后按“2.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，以峰面積積分值（A）為縱坐標(biāo)，姜黃素檢測(cè)濃度（c）為橫坐標(biāo)，制備各pH值下姜黃素的標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果見(jiàn)表5。

表2 因素水平Tab 2 Factors and levels

表3 正交試驗(yàn)結(jié)果Tab 3 Results of orthogonal test

表4 方差分析結(jié)果Tab 4 Results of variance analysis

表5 不同pH值姜黃素溫敏凝膠的標(biāo)準(zhǔn)曲線Tab 5 The standard curves of Curcumin thermosensitivehydrogels with different pH values

結(jié)果表明，在不同pH值的姜黃素溫敏凝膠中姜黃素檢測(cè)濃度在10～160 μg·mL－1范圍內(nèi)與峰面積積分值呈良好線性關(guān)系。

2.3.2 姜黃素降解速率的測(cè)定 將“2.3.1”項(xiàng)下制備的不同pH值下的姜黃素溫敏凝膠置于4℃冰箱中，于1、2、3、4、6、10、14、20d時(shí)分別取200μL不同pH值的姜黃素溫敏凝膠至10 mL量瓶中，用甲醇定容?；靹蚝蟀础?.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算姜黃素濃度（c），以c（μg·mL－1）對(duì)時(shí)間t（d）作圖，求不同pH值姜黃素溫敏凝膠的降解速率常數(shù)（k）、半衰期（t1/2），結(jié)果見(jiàn)表6。

表6 不同pH值姜黃素溫敏凝膠的降解方程及速率Tab 6 The degradation equations and degradation rates of Curcumin thermosensitive hydrogels with different pH values

結(jié)果表明，在4℃時(shí)，姜黃素溫敏凝膠隨時(shí)間的降解符合為零級(jí)動(dòng)力學(xué)過(guò)程。不同pH值的姜黃素溫敏凝膠的動(dòng)力學(xué)方程、k、t1/2均不相同，隨著pH值的升高，k加大。當(dāng)pH值為6.0時(shí)，t1/2＝150.93 d，表明pH值為6.0時(shí)姜黃素溫敏凝膠穩(wěn)定，且穩(wěn)定性明顯優(yōu)于姜黃素溶液（t1/2＝433.1h[5]），而當(dāng)pH≥6時(shí)，姜黃素溫敏凝膠的降解速率加快，故將姜黃素溫敏凝膠的pH定為6.0。

綜上所述，擬定姜黃素溫敏凝膠的處方為0.2%姜黃素、20%P407、4%P188、12%1，2-丙二醇、8%PEG400、磷酸鹽緩沖液加至100 mL，調(diào)pH值為6.0。

2.4 工藝驗(yàn)證試驗(yàn)

按上述最佳處方制備3批姜黃素溫敏凝膠（批號(hào)：20110301、20110302、20110303），分別測(cè)定其T、在膠凝溫度（36.5℃）時(shí)的η以及姜黃素的含量。結(jié)果，各指標(biāo)分別為（36.5± 0.41）℃（n＝3）、（823± 6.23）mPa·s、（0.207±0.0021）%（即劑量為2.07 mg·mL－1），姜黃素溫敏凝膠規(guī)格為2 mg·mL－1，所測(cè)姜黃素含量在常規(guī)含量限度范圍內(nèi)（1.8～2.2 mg·mL－1），含量符合規(guī)定。

3 討論

藥物輔料泊洛沙姆是由聚氧化乙烯與聚氧化丙烯組成的嵌段共聚物（PEO-PPO-PEO），由于聚氧乙烯鏈的相對(duì)親水性和聚氧丙烯鏈的相對(duì)親油性，使其具有表面活性，屬于非離子型表面活性劑。多數(shù)泊洛沙姆在較高濃度時(shí)可以形成水凝膠，主要是由于分子間形成氫鍵的結(jié)果[11]。以P407為例，當(dāng)其濃度高于15%時(shí)，可以形成凝膠。正交試驗(yàn)結(jié)果表明，隨著P407濃度的增加，膠凝溫度下降；與此相反，隨著P188濃度的增加，膠凝溫度則上升。加入溶劑1，2-丙二醇后，膠凝溫度降低，黏度升高，主要是因?yàn)?，2-丙二醇也可以與泊洛沙姆形成分子間氫鍵，形成更大的分子。加入溶劑PEG400后，膠凝溫度升高，黏度下降，PEG400的分子結(jié)構(gòu)與泊洛沙姆相似，且水溶性優(yōu)于泊洛沙姆，故使泊洛沙姆的水溶性降低，當(dāng)PEG400濃度過(guò)高時(shí)則無(wú)法形成凝膠。試驗(yàn)證明，P407濃度若為18%，當(dāng)PEG400的濃度大于15%時(shí)，不能形成凝膠，即無(wú)膠凝溫度。本試驗(yàn)根據(jù)正交試驗(yàn)結(jié)果，篩選出了最佳處方，既有適宜的膠凝溫度及黏度，又提高了姜黃素的含量，同時(shí)改善了姜黃素的穩(wěn)定性，克服了其水溶性差的缺點(diǎn)，進(jìn)而可提高姜黃素在體內(nèi)的生物利用度，使其具有更大的開(kāi)發(fā)和應(yīng)用價(jià)值。

[1]陳 喆，翟笑楓，蔣 棟，等.去甲斑蝥素-泊洛沙姆407緩釋劑和無(wú)水乙醇的肝癌瘤內(nèi)注射療效比較[J].第二軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào)，2001，22（7）：606.

[2]金璐燕，李 娟.泊洛沙姆407在制劑中的應(yīng)用進(jìn)展[J].藥學(xué)與臨床研究，2009，17（3）：231.

[3]杜廣增，趙浩如.Poloxamer407溫敏性即型凝膠的制備和應(yīng)用進(jìn)展[J].藥學(xué)進(jìn)展，2008，3（4）：163.

[4]胡 靜，李 立.姜黃素藥理作用研究現(xiàn)狀[J].檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)與臨床，2007，4（12）：1186.

[5]張宏穎，劉春平，唐建武，等.姜黃素對(duì)小鼠腹水型肝癌高淋巴道轉(zhuǎn)移細(xì)胞株（HCa-F）生物學(xué)行為的影響[J].中草藥，2005，36（11）：1663.

[6]韓 剛，霍 文，李秋影，等.姜黃素的穩(wěn)定性研究[J].中成藥，2007，29（2）：291.

[7]顧吉晉，鄧英杰，王 浩，等.RP-HPLC法測(cè)定大鼠血漿中姜黃素含量[J].成都醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2009，4（4）：241.

[8]申獻(xiàn)玲，胡 燕，雷 露，等.美洛昔康溫敏性水凝膠的制備及質(zhì)量控制[J].中國(guó)藥房，2008，19（25）：1069.

[9]高 斐，王東凱，羅 立，等.左氧氟沙星熱敏型眼用凝膠的研制及體外釋放研究[J].中國(guó)藥房，2005，16（14）：1057.

[10]宋 濤，王東凱，高 紅，等.利巴韋林鼻用溫敏凝膠熱力學(xué)和流變學(xué)性質(zhì)研究[J].中國(guó)醫(yī)藥工業(yè)雜志，2006，37（8）：540.

[11]王明坤，方曉玲.泊洛沙姆在藥劑學(xué)中的應(yīng)用[J].中國(guó)醫(yī)藥工業(yè)雜志，2002，33（12）：621.