HPLC法測定獸用中藥散劑中非法添加利巴韋林的方法研究

李樹綱，金錄勝，汪 洋，張 旭，張 宏，武生平

(1.甘肅省獸藥飼料監(jiān)察所，蘭州 730030;2.蘭州市衛(wèi)生學校，蘭州 730030;3.甘肅農(nóng)業(yè)大學，蘭州 730070﹚

利巴韋林(Ribavirin)是核苷酸類藥物，又名病毒唑、三氮唑核苷等，其化學結構與鳥苷相似，化學名為1－β －D－呋喃核糖基 －1Н －1，2，4－三氮唑－3－羧酰胺，是抗病毒藥，作用機理尚未完全明確。本品在體外具有抑制呼吸道合胞病毒、流感病毒、甲肝病毒、腺病毒等多種病毒生長的作用，進入體內對呼吸道合胞病毒也可能具免疫作用和中和抗體作用，其并不改變病毒吸附、侵入和脫殼，也不誘導干擾素的產(chǎn)生［1］。本品有較強的致畸作用，能引起胚胎損害，大劑量應用可致心臟損害等，屬于禁用獸藥。利巴韋林等人用抗病毒藥移植獸用，缺乏科學規(guī)范、安全有效的實驗數(shù)據(jù)，用于動物病毒性疫病不但給動物疫病控制帶來不良后果，而且影響國家動物疫病防控政策的實施。目前，一些不法分子在獸用中藥制劑中非法大量添加抗生素、抗病毒藥等化學藥品，這不僅違反了《獸藥管理條例》，而且易造成耐藥性的產(chǎn)生及動物性食品中藥物殘留，最終給人類身體健康造成了巨大的危害。本文旨在研究建立HPLC法測定獸用中藥散劑中非法添加利巴韋林的分析方法［2］。

1 試藥與儀器

1.1 試藥

1.1.1 對照品 利巴韋林對照品，批號為629－200202，來源于中國藥品生物制品檢定所。

1.1.2 供試品

1.1.2.1 陰性對照散劑 白龍散、白頭翁散、蒼術香連散、扶正解毒散、四味穿心蓮散、麻杏石甘散、黃連解毒散，購買合格藥材按《中國獸藥典》2010年版二部規(guī)定的處方自配。

1.1.2.2 陽性添加散劑 陽性添加散劑按照0.2 g/kg的比例在1.1.2.1項配制的散劑中添加利巴韋林對照品，混勻。

1.1.3 試劑 硫酸，分析純，北京化工廠。

1.2 儀器 Agilent 1100高效液相色譜儀(Agilent 1100可變波長紫外檢測器);ZORBAX SB－C18色譜柱(4.6 mm ×250 mm，5 μm);UF 型超純水機;TG18G臺式高速離心機(湖南凱達科學儀器有限公司，最大轉速為18000 r/min);電子天平(梅特勒－托利多儀器(上海)公司，AE240感量為0.00001，AE100感量為0.0001);實驗室 pH計(FE20，梅特勒－托利多儀器(上海)有限公司)。

2 實驗方法與結果

2.1 溶液的制備

2.1.1 供試品溶液的制備 分別稱取1.1.2項下的供試散劑1.0 g，置50 mL離心管中，精密加入流動相 20 mL，渦旋混勻，振搖提取 10 min，8000 r/min離心10 min，濾過，作為供試品溶液。

2.1.2 對照品溶液的制備 精密稱取利巴韋林對照品10 mg，置50 mL容量瓶中，加流動相適量，振搖使溶解，用流動相稀釋至刻度，作為對照品貯備液(0.2 mg/mL)，用時根據(jù)需要稀釋成相應的濃度。

2.2 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗 用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑;以水(用稀硫酸調節(jié)pH值至2.5 ±0.1)為流動相;流速 1.0 mL/min;進樣量20 μL;紫外檢測器檢測波長 207 nm［3］。按 2.1 項下的方法分別制備供試品溶液和對照品溶液，在上述色譜條件下，對其進行了進樣分析，利巴韋林主峰的保留時間為7.511 min，能夠與供試品中其他成分色譜峰很好地分離，峰形良好(圖1～圖15)。

2.3 線性范圍 分別精密吸取2.1.2項下的對照品貯備液 1.00、2.00、5.00、10.00、15.00、20.00 mL，置200 mL容量瓶，用流動相稀釋至刻度，配制系列標準溶液。按實驗確定的最佳條件進行測定，依照濃度由小到大的次序，按上述色譜條件進樣分析，以系列標準溶液濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標繪制標準曲線，得線性方程為Y=5.68×10X－5.61 ×10－2(r=0.9999，n=6)，結果表明利巴韋林在1.016 ～ 20.32 μg/mL 范圍內線性關系良好(圖16)。

圖16 利巴韋林的標準曲線

2.4 精密度試驗［4］取利巴韋林對照品溶液，按上述色譜條件重復連續(xù)進樣6次，每次進樣量為20 μL，測定峰面積，RSD 為 0.19%，表明此方法的儀器精密度符合要求。

2.5 重現(xiàn)性實驗［4］取同一品種的同一批供試品各5 份，按2.1.1 和2.1.2 項下操作，測定利巴韋林的峰面積，RSD為1.08%，表明此方法的重現(xiàn)性良好。

2.6 溶液穩(wěn)定性實驗 將同一供試品溶液3個不同濃度的溶液在室溫下考察，按上述色譜條件，分別于 1、3、6、10、24 h 測定峰面積，利巴韋林主峰面積的 RSD 分別為0.30%、0.26%、0.38%，表明24 h內利巴韋林在供試品溶液中是穩(wěn)定的(圖17～圖18)。

2.7 檢測限 按2.1.1項下的方法制備一定濃度的白龍散、白頭翁散、蒼術香連散、扶正解毒散、四味穿心蓮散、麻杏石甘散、黃連解毒散供試品溶液進行檢測，以信噪比(S/N)≥3為檢測限(LOD)，檢測限為2 mg/kg。

2.8 加樣回收率試驗 分別按 0.1、0.2、0.4 g/kg的添加濃度精密稱取利巴韋林對照品，加入1.1.2.1項下的自制散劑中，每個濃度做5份平行樣，按2.1.1項下的方法制備供試品溶液，與對照品平行進樣分析，按外標一點法，計算回收率及批內變異系數(shù)。本方法的回收率為81.28% ～119.46%，變異系數(shù)為0.88% ～1.65%(表1)。

3 討論

根據(jù)利巴韋林在水中易溶，在乙醇中微溶，在乙醚或二氯甲烷中不溶的特點，而且大多數(shù)中獸藥成分在水中不溶，因此，以流動相為溶劑溶解提取獸用中藥散劑中添加的利巴韋林，散劑中的其他組分峰與利巴韋林主峰的分離度符合要求，不影響利巴韋林的檢測。供試品中利巴韋林的提取以振搖提取10 min，8000 r/min離心10 min為好，從獸用中藥散劑中同時提取出的組分種類較少，不干擾利巴韋林的檢測。建立快速、靈敏、專屬的分析方法，為定性檢測和定量分析獸用中藥散劑里非法添加的西藥成分，具有重要的意義。本文研究建立了HPLC法測定獸用中藥散劑中非法添加利巴韋林的分析方法，簡便、快速，具有一定的實用價值。

表1 獸用中藥散劑中添加回收率試驗結果(n=5)

［1］ 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典二○一○年版二部［S］.

［2］ 胡 娟，龐文生，陳博毅，等.中成藥中非法添加利巴韋林檢測方法的研究［J］.福建中醫(yī)學院學報，2006，16(1):39 －41.

［3］ 傅 強.藥物分析試驗方法學［M］.北京:人民衛(wèi)生出版社，2008:7.

［4］ 楊秀玉，萬仁玲，馬玉葉，等.高效液相色譜法定性檢測5種中獸藥散劑中違規(guī)添加的氯霉素［J］.中國獸藥雜志，2006，40(12):11－14.