吡喹酮脂質(zhì)體凍干劑的制備及質(zhì)量評估

鄧 昉，匡光偉，，陳啟友，唐湘北，陳小軍，張大生，隆雪明，王 慧

(1.湖南省獸藥飼料監(jiān)察所，長沙 410006;2.湖南農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學院，長沙 410128;3.湖南省畜牧水產(chǎn)局，長沙 410006)

血吸蟲病是一種嚴重危害人類健康、影響社會經(jīng)濟發(fā)展的人畜共患寄生蟲病，流行于全世界76個國家，研究表明目前全世界約有2億人遭受感染，是一種嚴重危害人類健康的疾病之一［1－3］。近年來受我國長江季節(jié)性洪水等自然因素及人類活動頻繁等社會因素的影響，血吸蟲病疫情又出現(xiàn)反復，釘螺面積擴大，患病人數(shù)增加，急性感染呈上升趨勢，血防形勢嚴峻［4］。吡喹酮是用于防治血吸蟲病的首選藥物，目前臨床應用的吡喹酮制劑有片劑和膠囊，但其口服首過效應強，生物利用度低。作為靶向給藥系統(tǒng)的一種新劑型，脂質(zhì)體(Liposome，Lip)能有效延長藥物在機體內(nèi)的生物半衰期，提高療效，降低毒副作用［5－6］。然而，由卵磷脂(Soybean lecithin，PC)和膽固醇(Cholesterin，Chol)等組成的傳統(tǒng)脂質(zhì)體屬于熱力學不穩(wěn)定體系，在體內(nèi)外的弱穩(wěn)定性限制了其使用，極大地影響了其作為藥物載體的應用。利用冷凍干燥技術可以將吡喹酮脂質(zhì)體制成凍干劑型，能在很大程度上提高其穩(wěn)定性，并保持藥效。本文就吡喹酮脂質(zhì)體凍干劑的制備工藝及其質(zhì)量進行了研究。

1 材料

1.1 儀器與設備 高效液相色譜儀Agilent1200，Agilent科技有限公司;UV2100型紫外/可見光分光光度計，北京萊佰泰科儀器有限公司;透射電子顯微鏡JA210T型，日本Hitachi公司;旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀RE252型，上海亞榮生化儀器廠;激光散射粒徑分析儀Malvern22000型，英國 Malvern公司;超聲處理機JY98230型，寧波新芝生物科技有限公司;冷凍干燥機LGJ－12立式壓蓋型，北京松源華興科技發(fā)展有限公司。

1.2 藥品與試劑 吡喹酮對照品含量99.38%，批號0046－9120，中國藥品生物制品檢定所;大豆卵磷脂，北京美亞斯磷脂技術有限公司，批號110318;膽固醇 L0281，上海科興生物科技有限公司，批號100914;吡喹酮原料含量98.6%，齊魯動物保健品有限公司提供;乙腈、甲醇為色譜純;去離子水自制。

2 方法與結果

2.1 吡喹酮脂質(zhì)體凍干劑的制備 預試驗:在條件相同情況下，通過薄膜分散法、逆相蒸發(fā)法、乙醚注入法及超聲法分別制備吡喹酮脂質(zhì)體。根據(jù)其包封率高低，并結合吡喹酮的性質(zhì)和臨床用藥的目的、工藝的簡便程度確定薄膜超聲法制備吡喹酮脂質(zhì)體［7］。

正式試驗:參考文獻［7－8］，選取卵磷脂與膽固醇質(zhì)量比，加適量乙醚完全溶解后，加入吡喹酮原粉溶入其中，拌勻;置于梨形瓶中，35℃減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器減壓除凈有機溶劑，在梨形燒瓶內(nèi)壁形成一層均勻薄膜;加入含有適量維生素E的水合介質(zhì)，搖勻，靜置1 h;再放入玻璃珠數(shù)枚，置回旋震蕩器內(nèi)，震搖1～2 h洗膜，直至膜全部洗下為止，得牛奶狀多室脂質(zhì)體混懸液(MLVs)。采用探頭式超聲波粉碎機進行短時超聲30 s，得吡喹酮小單室脂質(zhì)體(SUVs)，裝入棕色試劑瓶中，密閉，冷凍保存［9］。同時同法同量制備一平行空白脂質(zhì)體，電鏡觀察結果顯示，脂質(zhì)體外觀圓整而且均勻(圖1)。

2.2 包封率的測定 結合吡喹酮本身的結構和特性，建立HPLC測定方法測定藥物的含量。

2.2.1 吡喹酮的色譜條件［10－11］Agilent ZORBAX SB C18(250 mm ×416 mm，5 μm)，流動相為乙腈 －0.1%乙酸(V∶V=4∶6)，流速1 mL/min，UV 檢測器檢測波長214 nm，柱溫30℃，進樣量20 μL。

圖1 吡喹酮脂質(zhì)體凍干劑電鏡圖

方法專屬性:吡喹酮對照品、吡喹酮脂質(zhì)體凍干劑和空白脂質(zhì)體凍干劑典型的色譜圖如圖2～圖4所示，吡喹酮保留時間約為8.4 min，輔料對藥物無干擾。

2.2.2 標準曲線的繪制 精密稱取吡喹酮25 mg溶于無水乙醇中，定容至50 mL，得0.5 mg/mL吡喹酮溶液。精密吸取該溶液 1、2、4、6、8、10 mL，分別置于100 mL容量瓶中，用無水乙醇稀釋至刻度，得濃度為 5、10、20、30、40、50 μg/mL 的溶液，用HPLC測定藥物的峰面積。將濃度(X)與峰面積(Y)進行線性回歸，得Y=300000X+24552，相關系數(shù)R ＞0.999，吡喹酮在濃度為 5 ～50 μg/mL 的范圍內(nèi)線性關系良好，檢測限為0.06 μg/mL。

2.2.3 加樣回收率 將脂質(zhì)體凍干劑解凍，分別準確量取0.2、0.4、0.8 mL 脂質(zhì)體樣品，用葡聚糖凝膠柱分離，用無水乙醇小心洗脫，接取洗脫液25 mL，該測定方法的加樣回收率為(98.4±1.5)%(n=3)。

2.2.4 樣品包封率測定 采用葡聚糖凝膠(Sephadex)柱色譜法［12］，將吡喹酮脂質(zhì)體凍干劑解凍，精密吸取吡喹酮脂質(zhì)體混懸液0.5 mL上柱，以乙腈－0.1%乙酸混合溶液為流動相洗脫，控制流速，每1.0 mL收集一試管，流出液管數(shù)與吸光度值曲線如圖5所示。

圖5 吡喹酮脂質(zhì)體洗脫曲線

根據(jù)Sephadex G250對大分子先被洗脫出來、小分子后出來的順序，收集合并游離的吡喹酮于100 mL容量瓶中，加流動相定容，搖勻，HPLC測定峰面積，計算游離吡喹酮含量。另精密吸取吡喹酮脂質(zhì)體混懸液0.5 mL，置100 mL容量瓶中，加無水乙醇破膜并定容至100 mL，用0.45 μm的微孔濾膜濾過，除去脂質(zhì)體碎片，取濾液，用HPLC測定峰面積，求得藥物含量，按下式計算包封率:包封率=(1－游離藥物含量/系統(tǒng)中的藥物總含量)×100%。

采用上述測定包封率的方法，檢驗3批吡喹酮脂質(zhì)體凍干劑樣品的包封率，包封率分別為(72.3±2.1)%、(73.2 ±2.7)%、(74.5 ±1.8)%(n=3)。

2.2.5 吡喹酮脂質(zhì)體凍干劑的穩(wěn)定性考察

2.2.5.1 抗光解性實驗 分別稱取吡喹酮脂質(zhì)體凍干劑和吡喹酮各若干份，照射10 d(強度3000 LX)，于 0、1、3、5、10 d 取樣測定含量。結果表明，包合物抗光解性優(yōu)于吡喹酮(表1)。

表1 吡喹酮脂質(zhì)體凍干劑和吡喹酮抗光解性試驗結果

2.2.5.2 熱穩(wěn)定性實驗 分別精密稱取吡喹酮脂質(zhì)體凍干劑和吡喹酮各若干份，密封于玻璃瓶中，分別于40、60、80℃恒溫干燥箱內(nèi)放置10 d，于0、1、3、5、10 d取樣測定含量。結果表明:吡喹酮脂質(zhì)體凍干劑的熱穩(wěn)定性明顯優(yōu)于吡喹酮(表2)。

表2 吡喹酮脂質(zhì)體凍干劑和吡喹酮抗熱穩(wěn)定性試驗結果

2.2.5.3 濕穩(wěn)定性實驗 分別精密稱取吡喹酮脂質(zhì)體凍干劑和吡喹酮適量，置入兩個密閉器皿中，相對濕度分別為75%(NaCl)和92.5%(KNO3)，于室溫放置10 d，于0、1、3、5、10 d 取樣測定含量。結果表明，在高濕條件下，吡喹酮脂質(zhì)體凍干劑較吡喹酮穩(wěn)定(表3)。

2.2.6 脂質(zhì)體的粒徑參數(shù) 測定3批吡喹酮脂質(zhì)體凍干劑的粒徑，結果分別為(237±5.5)、(254±4.9)、(249 ±6.1)nm。

2.2.7 凍干工藝及質(zhì)量評價 由于主要膜材磷脂易氧化、水解，脂質(zhì)體混懸液在儲存期間易發(fā)生聚集、融合及藥物滲漏，因此難以滿足藥物制劑穩(wěn)定性的要求，限制了其應用。本研究將脂質(zhì)體混懸液制成凍干粉劑，采用甘露醇作為凍干保護劑，分別制成5%、10%、15%(W/V)三個不同濃度的脂質(zhì)體進行凍結并冷凍干燥，通過比較各脂質(zhì)體凍干再水化后的形態(tài)和粒徑變化、凍干品外觀及包封率的變化來選擇保護劑的最佳比例，以期提高脂質(zhì)體的穩(wěn)定性(表4)。

表3 吡喹酮脂質(zhì)體凍干劑和吡喹酮抗?jié)穹€(wěn)定性試驗結果

表4 不同濃度凍干保護劑對包封率和粒徑的影響

3 討論

研究表明，制成凍干脂質(zhì)體可顯著降低磷脂和藥物的氧化及水解速度，同時，凍干保護劑可克服脂質(zhì)體聚集、融合及藥物滲漏等不穩(wěn)定因素，保持脂質(zhì)體膜結構的完整性，顯著提高貯存穩(wěn)定性［2］。該法與Vanleberghe報道采用冷凍干燥法提高脂質(zhì)體的貯存穩(wěn)定性相符［13－14］，已成為較有前景的改善脂質(zhì)體制劑長期穩(wěn)定性的方法之一。脂質(zhì)體在室溫條件下短期內(nèi)存放較穩(wěn)定，但隨著存放時間的延長，穩(wěn)定性有所下降，建議在－20℃冰箱中冷凍保存。

脂質(zhì)體凍結過程中形成的冰晶不僅會對脂質(zhì)體囊泡造成損害，而且會影響熱量的傳遞及水蒸氣的逸出。凍干品復水化后，大量的水透過脂質(zhì)體脂質(zhì)雙分子層，會導致藥物滲漏，包封水溶性藥物的大單室脂質(zhì)體這種現(xiàn)象尤其嚴重。如果在凍干前加入適宜的凍干保護劑，同時采用適宜的工藝，則可大大減輕、甚至消除凍干對脂質(zhì)體的破壞。

隨著生物工程技術的日益發(fā)展，生物醫(yī)藥產(chǎn)品，例如多肽、蛋白質(zhì)、酶及核酸類藥物的不斷增多，藥物的給藥穩(wěn)定性安全性成為藥物研發(fā)中迫切需要解決的重大難題。脂質(zhì)體作為這類藥物的常用載體，可以提高該類藥物的穩(wěn)定性、療效及安全性。然而由于脂質(zhì)體制備工藝較復雜，且不易擴大生產(chǎn)，同時凍干品的長期穩(wěn)定性也還有待于進一步提高，脂質(zhì)體的凍干工藝和凍干保護機理等還有待進一步研究。

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