不同方法提取卵黃抗體效果的比較

吳 博，王 爽，樊興冬，劉 宇，李 丹，史同瑞

(黑龍江省獸醫(yī)科學(xué)研究所，黑龍江齊齊哈爾 161006)

禽卵黃抗體(egg yolk immunoglobulins，IgY)是禽類B淋巴細(xì)胞在抗原物質(zhì)刺激下產(chǎn)生的沉積于卵黃中的一種免疫球蛋白［1］。由于卵黃抗體能夠靶向清除病原，療效理想且不產(chǎn)生毒副作用，不會(huì)激發(fā)補(bǔ)體系統(tǒng)，因此卵黃抗體已被廣泛應(yīng)用于動(dòng)物疾病的診斷、預(yù)防和治療工作。禽蛋黃中含有大量的蛋白質(zhì)和磷脂等大分子結(jié)構(gòu)物質(zhì)，動(dòng)物注射卵黃原液容易引起機(jī)體的腫脹、出血和壞死等嚴(yán)重的副反應(yīng)。因此，應(yīng)將卵黃中的免疫抗體與其他磷脂等物質(zhì)分離，從中提取純化卵黃抗體，以利于其應(yīng)用和保存［2］。目前，分離提取IgY的常用方法主要包括有機(jī)物沉淀法、有機(jī)溶劑抽提法、中鏈脂肪酸法、水稀釋法和無機(jī)鹽沉淀法。為了尋找比較適合工業(yè)化生產(chǎn)的工藝方法，本試驗(yàn)比較了具有代表性、且成本低、效率較高的5種改進(jìn)方法的IgY提取效果，以期為工業(yè)化生產(chǎn)提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 乳房炎病原菌高免蛋 用從患乳房炎病牛乳汁中分離鑒定的金黃色葡萄球菌制備滅活抗原，輔以弗氏佐劑后制成免疫原，間隔7～10 d連續(xù)三次強(qiáng)化免疫產(chǎn)蛋雞，定期收取雞蛋，應(yīng)用試管凝集法測(cè)定卵黃抗體效價(jià)。收集效價(jià)合格的雞蛋，貯存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2 試劑與儀器 辛酸，東京化成工業(yè)株式會(huì)社生產(chǎn);牛血清白蛋白(BSA)，北京元亨圣馬生物技術(shù)研究所;其他試劑均為國產(chǎn)分析純。紫外可見分光光度計(jì)(TU－1900)購自北京普析公司;酶標(biāo)儀，美國寶特公司生產(chǎn)。

1.2 方法

1.2.1 卵黃抗體提取方法 用清水洗凈高免雞蛋，然后用0.5%新潔爾滅溶液浸泡消毒20 min，無菌條件下去除卵清蛋白和卵黃膜，收集卵黃，將卵黃置于容器中，制成勻漿后，分別按下述方法提取卵黃抗體。

1.2.1.1 水稀釋法 取卵黃勻漿加6倍體積的蒸餾水，混合均勻，用1 mol/L的HCl調(diào)pH至5.0～5.2，攪拌均勻后均分4份，各取2份分置室溫和4℃環(huán)境靜置6～8 h，然后分別采用4000 r/min離心30 min和不離心兩種工藝提取卵黃抗體。

1.2.1.2 辛酸法 取卵黃勻漿與倍量體積醋酸－醋酸鈉緩沖液(pH 5.2，0.12 mol/L)混合均勻，然后向混合液中加入終濃度1% ～3%辛酸，混勻均勻，均分4份，各取2份分置室溫和4℃環(huán)境靜置6～8 h，然后分別采用4000 r/min離心30 min和不離心兩種工藝提取卵黃抗體［3］。

1.2.1.3 乙酸－乙酸鈉法 取卵黃勻漿加9倍體積醋酸 － 醋酸鈉緩沖液(pH 5.2，0.12 mol/L)混合，攪拌10 min，均分4份，各取2份分置室溫和4℃環(huán)境靜置6～8 h，然后分別采用4000 r/min離心30 min和不離心兩種工藝提取卵黃抗體［4－5］。

1.2.1.4 酚沉淀法 取卵黃勻漿與2.4%苯酚溶液按體積比1∶3比例混合均勻，均分4份，各取2份分置室溫和4℃環(huán)境靜置6～8 h，然后分別采用4000 r/min離心30 min和不離心兩種工藝提取卵黃抗體。

1.2.1.5 海藻酸鈉法 取卵黃勻漿與等體積蒸餾水混勻，然后與等體積0.1% ～0.14%海藻酸鈉溶液(含0.04%NaCl)混合，用1 mol/L的 NaOH 或HCl調(diào)pH至5.2，均分4份，各取2份分置室溫和4℃環(huán)境靜置6～8 h，然后分別采用4000 r/min離心30 min和不離心兩種工藝提取卵黃抗體［6－7］。

1.2.2 液體組分回收率測(cè)定 液體組分回收率是指用不同方法所提取回收的卵黃水溶性組分(WSF)與初始卵黃勻漿中加入液體量的比率。由于IgY溶于水，所以提取的液體量越多，即液體組分回收率越高，IgY提取量也就越多。

1.2.3 蛋白含量測(cè)定 以牛血清白蛋白(BSA)為標(biāo)準(zhǔn)蛋白，采用考馬斯亮藍(lán)法(Bradford)測(cè)定上清液中的蛋白含量［8－9］。

按表1加入試劑，靜置5 min后在波長(zhǎng)595 nm處測(cè)定光密度值。以光密度值為縱坐標(biāo)，蛋白質(zhì)濃度為橫坐標(biāo)，在坐標(biāo)軸上繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并計(jì)算回歸方程。

表1 繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線不同編號(hào)試管所需試劑

取經(jīng)室溫靜置離心提取的卵黃抗體待測(cè)樣品，調(diào)整其測(cè)定的蛋白濃度值在標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性范圍內(nèi)，根據(jù)所測(cè)定的595 nm處吸收值和相關(guān)系數(shù)，計(jì)算出待測(cè)樣品的蛋白質(zhì)濃度。

1.2.4 卵黃抗體效價(jià)測(cè)定 采用試管凝集試驗(yàn)測(cè)定不同方法提取卵黃抗體的抗體效價(jià)。用5%石碳酸生理鹽水將提取的IgY水溶液作倍比稀釋，然后加入等體積金黃色葡萄球菌凝集抗原，抗原濃度為2×109CFU/mL，同時(shí)用生理鹽水對(duì)照，充分振搖混合后，置37℃溫箱感作4～10 h，然后判定結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 卵黃抗體性狀與回收率 試驗(yàn)結(jié)果表明，酚沉淀法提取的卵黃抗體液為無色澄清體液，其他4種方法提取的卵黃抗體液均為黃色、稍混濁體液。從提取量上看，辛酸法的液體回收率最高，達(dá)到171%。在室溫或4℃環(huán)境靜置不離心條件下，只有酚沉淀法有卵黃水溶性組分自然析出，其回收率分別為50%和38%(表2)。

表2 不同方法提取卵黃抗體液的物理性狀及回收率

2.2 蛋白含量及卵黃抗體效價(jià) 將蛋白質(zhì)BSA標(biāo)準(zhǔn)溶液系列濃度的光密度值(Y)與蛋白質(zhì)濃度(X)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程 Y=0.619X －0.004，r2=0.994，標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖1。取適宜體積的待測(cè)樣品，使其測(cè)定值在標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性范圍內(nèi)。根據(jù)595 nm處OD值，在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出蛋白含量，并計(jì)算出濃度。試驗(yàn)結(jié)果表明，辛酸法提取蛋白的濃度最高，為6.6 mg/mL，而乙酸－乙酸鈉法提取的蛋白濃度最低，為1.2 mg/mL。辛酸法和海藻酸鈉法提取卵黃抗體的凝集效價(jià)最高，為1∶128，乙酸－乙酸鈉法提取卵黃抗體的效價(jià)最低，為1∶16。具體結(jié)果見表3。

圖1 測(cè)定蛋白質(zhì)含量的標(biāo)準(zhǔn)曲線

表3 不同方法提取液蛋白含量及卵黃抗體效價(jià)

3 討論

3.1 卵黃的主要成分是水、蛋白質(zhì)和脂肪，其中蛋白質(zhì)與脂肪的組分比約為1∶2，幾乎所有的脂肪均與蛋白質(zhì)結(jié)合形成了脂蛋白。在卵黃中只有α、β、γ卵黃球蛋白溶于水，IgY屬于γ卵黃球蛋白，溶于水。根據(jù)IgY溶于水的特性，卵黃抗體應(yīng)存在于提取的回收液及卵黃的水相中。本試驗(yàn)通過比較加入卵黃勻漿中液體的回收率，即提取液體的數(shù)量，探討了5種提取方法的優(yōu)劣。加入液體的回收率越高，提取的卵黃抗體亦越多，卵黃中IgY的提取也就越徹底;提取的液體越澄清，說明雜質(zhì)去除得越徹底，IgY純度也就越高。試驗(yàn)結(jié)果表明，辛酸法液體的回收率最高，達(dá)到171%，其次是酚沉淀法，回收率為105%。由此可見，辛酸法是提取效率較高的方法，其次是酚沉淀法和水稀釋法，這與鄭立勇等［10］的試驗(yàn)結(jié)果基本一致。

3.2 工藝條件試驗(yàn)表明，在室溫和4℃環(huán)境靜置條件下，4000 r/min離心30 min和不離心提取卵黃抗體，只有酚沉淀法有卵黃水溶性組分自然析出，其回收率分別為50%和38%，說明采用自然沉淀方法不適宜卵黃抗體的提取。在離心條件下，比較室溫和4℃環(huán)境靜置提取效果，結(jié)果提取量無顯著差異，考慮生產(chǎn)成本和工藝優(yōu)化，推薦采用室溫靜置離心工藝。氯仿法雖可采用自然沉淀法提取卵黃抗體，但考慮氯仿污染環(huán)境，對(duì)人體有毒，因而不適宜規(guī)?；a(chǎn)。張倫等［11］研究了泊洛沙姆－辛酸法對(duì)雞卵黃的脫脂條件，該方法采用過濾抽提工藝且不需離心，工藝簡(jiǎn)便，值得探討和在產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)中應(yīng)用。本試驗(yàn)尚未比較在卵黃勻漿與加入液體的不同體積比、卵黃混合液不同靜置時(shí)間、不同離心速度條件下各種方法的提取效果，為了制定更加科學(xué)的生產(chǎn)工藝，還有待進(jìn)一步試驗(yàn)。

3.3 在提取液蛋白含量及卵黃抗體效價(jià)試驗(yàn)中，辛酸法提取蛋白的濃度最高，為6.6 mg/mL，其次是海藻酸鈉法，而乙酸－乙酸鈉法提取的蛋白濃度最低，為1.2 mg/mL。辛酸法和海藻酸鈉法提取卵黃抗體的凝集效價(jià)最高，為1∶128，其次是水稀釋法和酚沉淀法，乙酸－乙酸鈉法提取的卵黃抗體效價(jià)最低，為1∶16。由試驗(yàn)結(jié)果可見，隨著回收液中蛋白質(zhì)的含量增多，效價(jià)也相應(yīng)增高，但因無法完全消除雜蛋白，所以抗體效價(jià)并不是隨著蛋白含量完全成線性比例增加。在本試驗(yàn)中，雖然各種方法提取卵黃抗體的蛋白含量及其效價(jià)不同，但由于在提取卵黃抗體時(shí)各方法卵黃勻漿與加入液體的體積比存在差異，因此僅從提取原液的蛋白含量及效價(jià)尚不能直接說明方法的提取效果。試驗(yàn)有待將各方法提取的單位體積卵黃勻漿抗體進(jìn)行濃縮，并調(diào)節(jié)至相同體積卵黃抗體液，然后再測(cè)定其蛋白含量及效價(jià)，以更加直觀地證實(shí)提取效果。

3.4 在動(dòng)物疾病的診斷和治療方面，雖然卵黃抗體具有廣闊的應(yīng)用前景，但國內(nèi)還沒有關(guān)于卵黃抗體提取的科學(xué)生產(chǎn)工藝和產(chǎn)品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，這在一定程度上限制了卵黃抗體的開發(fā)與應(yīng)用。加快研究制訂卵黃抗體產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)工藝和質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，有利于促進(jìn)卵黃抗體產(chǎn)業(yè)化。目前，隨著研究進(jìn)展，卵黃抗體提取方法也在不斷的發(fā)展與更新，但由于受到成本、安全性、產(chǎn)量和活性等諸多條件的限制，適用于大規(guī)模生產(chǎn)的方法并不多。衡量某一提取方法的優(yōu)劣，要從工藝條件難易、工藝路線長(zhǎng)短以及回收率和純度等多方面綜合評(píng)價(jià)。在本試驗(yàn)5種提取方法中，由于水稀釋法、辛酸法、乙酸－乙酸鈉法、酚沉淀法和海藻酸鈉法的卵黃稀釋倍數(shù)分別為1∶6、1∶1、1∶9、1 ∶3、1 ∶1，綜合考慮卵黃稀釋倍數(shù)、提取液體量、卵黃抗體蛋白含量、抗體效價(jià)及使用情況等因素，筆者認(rèn)為辛酸法具有生產(chǎn)成本低、產(chǎn)品回收率高、對(duì)環(huán)境污染小等優(yōu)點(diǎn)，比較適合工業(yè)化生產(chǎn)。

［1］ Hatta H，Kim M，Yamamoto T A.Novel isolation method for egg yolk antibody，“l(fā)gY”［J］.Agric Biol Chem，1990，54:2531 －2533.

［2］ 吳開寶，張振興.獸用卵黃抗體的特點(diǎn)及應(yīng)用［J］.畜牧與獸醫(yī)，2007，39(11):62 －63.

［3］ Poison A.Detection of microbial antibodies in chickens:immunofluorescence studies with serum and egg yolk［J］.Proc Soc Exp Bio Med，1969，131(4):1150 －1153.

［4］ Jenc Chr Jensenius，Andersen I，Hau J，et al.Eggs:Conveniently Packaged Anibodies，Methods for Purification of Yolk IgG［J］.J Immunol Methods，1981，(46):63 －68.

［5］ Fichtali J，Charter E A，Lo K V，et al.Separation of Egg Yolk Immunoglobulins Using an Automated Liquid Chromatography System［J］.Biotechnology and Bioengineering，1992，40(11):1388－1394.

［6］ Andreas Hassl，Aspock.Purification of Egg Yolk Immunoglobulins:A Two－step Procedure Using Hydrophobic Interaction Chromatography and Gel Filtration［J］.J Immunol Methods，1988，110:225 －228.

［7］ Hatta H，Sim J S，Nakai S.Separation of phospholipid from Egg Yolk and Recovery of Water － soluble Protein［J］.J food Sci，1988，53(2):425 －427.

［8］ 汪家政，范 明.蛋白質(zhì)技術(shù)手冊(cè)［M］.北京:科學(xué)出版社，2001.

［9］ 甄宇紅.抗奶牛乳腺炎特異性卵黃抗體的制備及活性研究［D］.大連:大連理工大學(xué)，2008.

［10］鄭立勇，喬彥良，馬鳳龍，等.卵黃抗體不同提取方法的比較［J］.黑龍江畜牧獸醫(yī)，2009，(1):106 －107.

［11］張 倫，高 軒，李明義.泊洛沙姆－辛酸法對(duì)雞卵黃脫脂條件的研究［J］.中國動(dòng)物檢疫，2011，3:49－51.