TGF-β1、CTGF基因的過表達與早期糖尿病腎病關(guān)系的研究*

于 倩 張 沫 劉德敏

糖尿病腎?。―N）早期處于高功能狀態(tài)，腎血流量增加，腎小球濾過率增高，尿微量蛋白正常，病理變化表現(xiàn)為腎小球肥大，系膜基質(zhì)輕度增寬，腎小球基底膜輕度增厚。這種過程是可逆的，但隨著病程延長，當尿蛋白排泄率超過0.5 g/d時，即為臨床糖尿病腎病期，此過程不可逆，最終發(fā)展為終末期腎病，只能依靠腎移植、血液透析和腹膜透析等腎臟替代療法來維持生命，因此積極探索DN的發(fā)病機制，在DN早期給予適當及時的干預措施至關(guān)重要。在DN發(fā)病機制的研究中，由糖基化終末產(chǎn)物介導的轉(zhuǎn)化生長因子（TGF）-β1/Smad/結(jié)締組織生長因子（CTGF）通路最為重要，大量研究表明TGF-β 1和CTGF在腎病進程中起著關(guān)鍵作用[1]，但TGF-β1和CTGF基因表達與早期DN的關(guān)系還不清楚。本研究旨在探討TGF-β1和CTGF基因表達與糖尿病早期腎臟病變的關(guān)系及其作用機制，為臨床DN的早期治療提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 （1）實驗動物。清潔級雄性SD大鼠27只，購自天津?qū)嶒瀯游镏行模?周齡，體質(zhì)量250～300 g，平均（281±11）g。實驗期間標準條狀飼料喂養(yǎng)，自由進食、飲水，每籠6～7只，自然晝夜光線，室內(nèi)通風良好，室溫18℃～22℃，相對濕度40%～70%。（2）主要試劑。鏈脲佐菌素（STZ，Sigma公司），Trizol、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（北京全式金公司），Real-time PCR試劑盒[大連寶生物（TaKaRa）公司],小鼠抗TGF-β1單克隆抗體、山羊抗CTGF多克隆抗體（Santa Cruz biotechnology），SABC免疫組化染色試劑盒、DAB顯色試劑盒（武漢博士德公司）。（3）主要儀器。德國BIOSEN血糖分析儀，芬蘭Quik read快速分析儀，日立CF-15D冷凍離心機，中國博日Line-Gene K熒光定量PCR儀。

1.2 動物模型的建立與分組 全部動物適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后隨機分為2組：正常對照組（NC）12只，糖尿病組（DM組）15只。將STZ溶于0.1mol/L的無菌枸櫞酸-枸櫞酸鈉緩沖液（pH 4.4），配成2%的溶液。DM組大鼠按40 mg/kg體質(zhì)量尾靜脈注射STZ，對照組注射枸櫞酸鈉緩沖液。給藥后72 h和第7天尾靜脈取血測隨機血糖，2次血糖均≥16.7 mmol/L為造模成功，共14只成模為DM組。

1.3 標本收集與處理 自成模之日起，每2周測血糖1次。第8周時將大鼠置于單個代謝籠中，收集24 h尿液，記錄尿量，3 000 r/min離心3 min后留取上清于-20℃保存，用于24 h尿微量蛋白（UMA）的測定。第8周末，將全部大鼠稱質(zhì)量，測血糖，股動脈放血將大鼠處死，留取血標本，3 000 r/min離心5 min后取血清于-20℃凍存，待測血糖、血尿素氮（BUN）、血肌酐（Scr）等生化指標。將大鼠腹腔打開，迅速摘取雙腎，左腎稱質(zhì)量后迅速放入10%福爾馬林固定，右腎去除包膜后留取腎皮質(zhì)部分于凍存管中，編號后放入液氮保存，24 h后放入-70℃冰箱中凍存?zhèn)溆?，用于Real-time PCR測定。

1.4 實驗方法

1.4.1 生化指標的測定 血糖檢測用葡萄糖氧化酶電極法，BUN、Scr測定用酶法，24 h尿微量蛋白檢測用免疫透射比濁法。

1.4.2 腎臟肥大指數(shù)（KI） 用腎質(zhì)量/體質(zhì)量（g/kg）比值表示。

1.4.4 腎皮質(zhì)TGF-β1、CTGFmRNA表達測定 （1）腎皮質(zhì)總RNA提取。用Trizol按步驟提取大鼠腎皮質(zhì)總RNA，紫外分光光度計測定每個樣品OD260/OD280比值，結(jié)果在1.8～2.0為純度較高，并計算濃度，采用1%的瓊脂糖凝膠電泳鑒定RNA完整性。（2）cDNA的合成。以RNA為模板，oligo（dT）為引物，在逆轉(zhuǎn)錄酶MMLV的催化下合成cDNA。（3）引物合成。根據(jù)引物設(shè)計原則，應(yīng)用Primer 6.0軟件設(shè)計引物，′用NCBIblast評價，再由上海生工合′成。β′-actin引物上游5-CCCATCTA TGA′GGGTTACGC-3，下游5-TTTAATGT′CACGCACGATTT C-3，擴增產(chǎn)物1′50 bp；TG′F-β1引物上游5-CAACAACG′CAA TCTATGACA-3，下游5-CAAGG′TAACGCCAGGAAT-3，擴增產(chǎn)′物 200 bp′；C TGF引物上游5-TGCCTG′CCATTACAACT G-3，下游5-CACACGGTTCTCACTTCG-3，擴增產(chǎn)物247 bp。（4）Real-time PCR。SYBRGreenⅠ與雙鏈DNA結(jié)合后發(fā)出熒光，通過檢測反應(yīng)體系中的SYBRGreenⅠ的熒光強度監(jiān)測RCR產(chǎn)物的擴增量。反應(yīng)體系包括12.5μL SYBR Premix Ex Taq，上下游引物各0.5μL，cDNA模板2μL，ddH2O 9.5 μL，總體系為25μL。PCR擴增條件：95℃預變性30 s；95℃變性5 s，60℃退火及延伸30 s，共40個循環(huán)；最后生成熔解曲線。目的基因與內(nèi)參基因擴增閾值的差值，即△Ct值，根據(jù)公式2-ΔCt計算出樣品初始模板量進行分析。

1.4.5 免疫組織化學法檢測 固定的腎組織經(jīng)乙醇逐級脫水，石蠟包埋切片（4μm），用免疫組化SABC法檢測。實驗中TGF-β1、CTGF蛋白一抗?jié)舛葹?∶150，用PBS代替一抗做陰性對照，4℃孵育過夜，滴加二抗，DAB顯色，蘇木素復染。結(jié)果分析參考文獻[2]，采用Image-Pro Plus 6.0圖像分析系統(tǒng)對圖像進行分析,每張切片隨機讀取10個不重疊的視野，計算其積分光密度（IOD），取其均值進行統(tǒng)計學分析。

1.5 統(tǒng)計學分析 應(yīng)用SPSS17.0統(tǒng)計軟件做數(shù)據(jù)分析。所有資料均進行正態(tài)性檢驗，計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，2組間比較采用獨立樣本t檢驗；非正態(tài)分布資料以中位數(shù)（四分位數(shù)間距）表示，2組間比較采用Mann-Whitney檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 動物成模情況及體征觀察 DM組大鼠于造模3 d后出現(xiàn)多飲、多食、多尿癥狀，常伴有腹瀉，毛發(fā)干枯發(fā)黃，隨時間的推移體質(zhì)量明顯減輕，活動量減少，精神萎靡。NC組大鼠皮毛光滑、毛色正常，體質(zhì)量隨周齡增加而增加，精神狀況佳，飲食、飲水正常，尿淡黃色，大便顆粒狀。實驗期間NC組大鼠無死亡，DM組死亡2只，主要集中在造模后2周。

2.2 實驗室檢查結(jié)果 前4周時，與NC組相比，DM組血糖明顯升高（P<0.01）；6周后，DM組血糖略有降低，但仍明顯高于NC組，見表1。與NC組相比，DM組血肌酐明顯下降，血尿素氮明顯升高（均P<0.01），見表2。與NC組相比，DM組24 h尿量升高明顯，24 h UMA、腎肥大指數(shù)也明顯增高，差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.01），見表2。

與NC組相比，DM組TGF-β1、CTGF mRNA水平明顯升高（P<0.01），見表3。

免疫組化結(jié)果顯示，NC組腎臟TGF-β1在腎小球輕度染色，DM組腎小球著色明顯增多增深，蛋白表達較NC組高（P<0.01）；NC組腎小球未見明顯著色，而DM組大鼠腎小球CTGF表達增多著色明顯，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.01），見表3，圖1、2。

Table1 Comparison of blood sugar in different rat groups表1 各組大鼠不同周齡血糖比較 （n=12，mmol/L，±s）

Table1 Comparison of blood sugar in different rat groups表1 各組大鼠不同周齡血糖比較 （n=12，mmol/L，±s）

**P<0.01；表2、3同

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Table 2 Comparison of correlation index of renal function between rat groups表2 各組大鼠腎功能相關(guān)指標比較 （n=12）

Table 3 Expression levels of TGF-β1,CTGF mRNA and protein in rat renal cortex表3 大鼠腎皮質(zhì)TGF-β1、CTGF mRNA及蛋白表達水平（n=12，±s）

Table 3 Expression levels of TGF-β1,CTGF mRNA and protein in rat renal cortex表3 大鼠腎皮質(zhì)TGF-β1、CTGF mRNA及蛋白表達水平（n=12，±s）

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Figure1 Resultsof nephridialtissue TGF-β1 detected by immunohistochemistry圖1 腎組織TGF-β1免疫組化結(jié)果（SABC法×400，箭頭所示為陽性棕色顆粒沉著）

Figure2 Resultsof nephridialtissue CTGFdetected by immunohistochemistry圖2 CTGF腎組織免疫組化結(jié)果（SABC法×400，箭頭所示為陽性棕色顆粒沉著）

3 討論

3.1 糖尿病腎病大鼠模型的建立 目前，STZ誘導建立的DM模型廣泛應(yīng)用于DN發(fā)病機制和治療方法的研究。STZ通過選擇性抑制β細胞O-乙酰葡萄糖胺酶（O-GlcNAcase）的活性，從而抑制O-乙酰葡萄糖胺的降解，使β細胞內(nèi)蛋白質(zhì)不可逆地糖基化，導致β細胞死亡。高劑量注射STZ使胰島素分泌嚴重受損，模擬了1型糖尿??；而低劑量STZ使胰島素分泌輕度受損，具有2型糖尿病后期的特征[3]。近來研究發(fā)現(xiàn)，采用單側(cè)腎臟切除或單側(cè)腎臟結(jié)扎后再小劑量注射STZ，也可以成功建立DN模型，但是由于難于分辨單側(cè)腎損傷和STZ誘導高血糖對腎小球血流動力學改變的作用，該模型的應(yīng)用價值尚待討論[4]。無論從腎臟生理解剖特點還是DN的發(fā)病機制、病理特征等方面，還沒有一種動物模型能完全模擬人類的糖尿病腎臟損害，應(yīng)根據(jù)研究目的選擇模型的建立方法。本實驗研究早期DN的分子機制及可能的治療方法，因此采用尾靜脈小劑量注射STZ的方法建立DN模型。

3.2 細胞因子與DN TGF-β1是DN病程進展的重要細胞因子，是導致細胞外基質(zhì)（ECM）過度沉積的關(guān)鍵因子，通過TGF-β/Smad通路與靶基因的啟動子區(qū)域結(jié)合，調(diào)控其轉(zhuǎn)錄[5]，其中CTGF是其主要的效應(yīng)因子，與TGF-β1共同參與腎臟肥大、系膜基質(zhì)擴張、膠原增加和纖維黏連蛋白mRNA的表達等作用。CTGF是一種富含半胱氨酸的分泌蛋白，能與多種細胞因子相互作用，在維持細胞外基質(zhì)的動態(tài)平衡中發(fā)揮了重要作用[6]。CTGF通過vWC結(jié)構(gòu)域與TGF-β1結(jié)合，從而加強TGF-β1與相應(yīng)受體的結(jié)合，提高了TGF-β1的有效濃度，同時還參與調(diào)節(jié)其信號轉(zhuǎn)導。研究顯示，在CTGF基因缺失或基因敲除的細胞中，由TGF-β1介導的30%的基因都失去了對它的反應(yīng)[7]。TGF-β1功能的實現(xiàn)離不開CTGF,只有當兩者協(xié)調(diào)作用時，才能促使發(fā)生持續(xù)的纖維化反應(yīng)[8]。

3.3 糖尿病腎病標志物 在腎臟疾病中，特別是DN，UMA可以預示腎功能的損害程度，與腎病的進程密切相關(guān)。李世芬等[4]通過檢測STZ誘導的DN大鼠的24 h尿蛋白排出量發(fā)現(xiàn)，模型組在造模1周時就明顯升高，提示此時就已經(jīng)存在腎功能的損害，并且排出量隨著病程的延長而增多。但是，近來研究發(fā)現(xiàn)腎小球及腎小管損傷引起的細胞內(nèi)蛋白質(zhì)的變化要早于尿蛋白的出現(xiàn)[9]，UMA用于診斷DN的進程具有較高的靈敏度，但是特異度較低。

DN早期病理生理改變主要是高濾過和微量蛋白尿，隨后出現(xiàn)腎功能進一步損害。本研究DM組大鼠的病變處于糖尿病腎病早期，DM組CTGF mRNA及蛋白表達較NC組明顯升高，說明CTGF表達在腎病早期即有增加。有研究顯示，與正常蛋白尿的DN患者比較，微量蛋白尿組的DN患者尿中的CTGF高出10倍，大量蛋白尿組高出100倍[10]。Je?rums等[11]研究表明，CTGF陽性細胞數(shù)及尿CTGF與腎組織活檢纖維化評分呈正相關(guān)。這些結(jié)果提示通過檢測CTGF來評價腎臟損傷將具有更好的特異性，有研究者提出聯(lián)合應(yīng)用CTGF與UMA來區(qū)分大血管損傷性疾病和腎臟疾病[12]，這對DN的早期診斷將更有意義。

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