應(yīng)用蛋白質(zhì)組技術(shù)篩選人食管癌細(xì)胞系9706順鉑耐藥相關(guān)蛋白

晁瑋霞，劉 琳，卜旺雨，張 娟，侯艷芳，高小飛，牛保華，馬遠(yuǎn)方，齊義軍＊

（1河南大學(xué)醫(yī)學(xué)院 細(xì)胞與分子免疫學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南 開(kāi)封475004；2河南大學(xué)醫(yī)學(xué)院 機(jī)能實(shí)驗(yàn)室，河南 開(kāi)封475004；3河南職工醫(yī)學(xué)院 護(hù)理教研室，河南 鄭州451191）

食管癌（esophageal cancer，EC）的發(fā)病率和死亡率在世界上分別列第7位和第6位，全球每年至少有40萬(wàn)EC死亡病例，約有一半發(fā)生在中國(guó)［1－2］。與歐美等發(fā)達(dá)國(guó)家發(fā)生的EC組織學(xué)類(lèi)型以腺癌為主的不同，中國(guó)的EC 90%屬食管鱗狀細(xì)胞癌（esophageal squamous cell carcinoma，ESCC）［3］。目前對(duì) EC采用以手術(shù)治療為主、放療和化療為輔的綜合治療措施，但EC愈后極差，約有50%的EC患者在術(shù)后的2～3a內(nèi)復(fù)發(fā)［4］，5a生存率小于10%［5］。EC愈后差的主要原因?yàn)椋菏状未_診的EC約有一半已發(fā)展至中晚期；腫瘤細(xì)胞具有較強(qiáng)侵襲性；化療過(guò)程中獲得多藥耐藥性等。目前，臨床普遍采用順鉑（cis-diamminedichloroplatinum，CDDP）和5-氟尿嘧啶（5-FU）的標(biāo)準(zhǔn)化療方案治療EC，而多藥耐藥性是臨床EC化療失敗的最主要原因之一。因此，建立人食管癌順鉑耐藥細(xì)胞系、篩選耐藥相關(guān)蛋白、探討耐藥作用相關(guān)分子機(jī)制，對(duì)尋找逆轉(zhuǎn)食管癌耐藥性的分子靶點(diǎn)具有重要理論意義和應(yīng)用價(jià)值。

本研究以食管鱗癌細(xì)胞系EC9706為細(xì)胞模型，采用CDDP濃度遞增法、間歇作用方式建立了EC9706順鉑耐藥細(xì)胞系（EC9706／CDDP），細(xì)胞培養(yǎng)穩(wěn)定同位素標(biāo)記（cell culture and stable isotope labeling，SILAC）、質(zhì)譜（mass spectrometry，MS）篩選和鑒定食管癌耐藥相關(guān)的蛋白，以揭示食管癌耐藥性發(fā)生的分子機(jī)制和提供食管癌耐藥性逆轉(zhuǎn)有意義的分子靶點(diǎn)。

1 材料和方法

1.1 試劑

順鉑（CDDP）、四甲基偶氮唑藍(lán)（MTT）購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；RPMI1640培養(yǎng)基購(gòu)自Gibco／BRL公司；胎牛血清購(gòu)自四季青；NUPAGE 120g／L Bis-tris gel和SILACTM標(biāo)記試劑盒購(gòu)自Invitrogen。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞系、細(xì)胞培養(yǎng)以及EC9706／CDDP的建立 EC9706由本室凍存，細(xì)胞復(fù)蘇后在含體積分?jǐn)?shù)為10%胎牛血清及青霉素、鏈霉素各100U／mL的RPMI1640培養(yǎng)基中，置37℃、體積分?jǐn)?shù)為5%CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細(xì)胞生長(zhǎng)良好達(dá)80%匯合度，用體積分?jǐn)?shù)為0.25%胰酶消化傳代，待細(xì)胞貼壁后，加入含0.25mg／L CDDP的RPMI1640培養(yǎng)基培養(yǎng)48h，更換為不含CDDP的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，待細(xì)胞生長(zhǎng)穩(wěn)定后，再次加入含0.25mg／L CDDP的RPMI1640培養(yǎng)基培養(yǎng)。如此反復(fù)處理至細(xì)胞耐受該濃度后，依次加大濃度→0.5mg／L 5次→1mg／L 5次→2mg／L 5次［6］，建立 EC9706／CDDP并繼續(xù)在含0.5mg／L CDDP的RPMI1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)。

1.2.2 MTT法測(cè)定EC9706／CDDP對(duì)CDDP的敏感性 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞EC9706／CDDP及敏感母系細(xì)胞EC9706，調(diào)整細(xì)胞密度為1×104／mL，以200μL／孔加入96孔板，24h后換為含不同濃度CDDP的RPMI1640培養(yǎng)基培養(yǎng)，每一濃度作3平行孔，并設(shè)空白對(duì)照。培養(yǎng)72h后，常規(guī) MTT法檢測(cè)，酶標(biāo)儀于波長(zhǎng)550nm處測(cè)吸光度 （A）值，重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次。計(jì)算相對(duì)抑制率（%）＝（1－加藥孔A值／對(duì)照孔A值）×100%，IC50為50%細(xì)胞生長(zhǎng)受抑制時(shí)的藥物濃度，耐藥指數(shù)（RI）＝（EC9706／CDDP）IC50／（EC9706）IC50［3］。

1.2.3 SILAC培養(yǎng)并標(biāo)記 取對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)良好的細(xì)胞，消化傳代，分別用含 ［U-13C6］-H-Lysine和［U-13C6］-H-Arginine （重 型）、［12C6］-L-Lysine 和［12C6］-L-Arginine（輕型）的 RPMI1640培養(yǎng)基培養(yǎng)標(biāo)記EC9706、EC9706／CDDP細(xì)胞。根據(jù)供應(yīng)商建議，傳代比例為1∶10，至少傳代6次保證細(xì)胞標(biāo)記完全。

1.2.4 細(xì)胞收集并裂解 胰酶消化標(biāo)記完全的EC9706、EC9706／CDDP細(xì)胞，PBS洗滌3次，最后將混懸液收集到1.5mL Ep管中，4 000r／min，離心10min，棄去洗液，加入含有蛋白酶抑制劑的完全裂解液200μL，冰上裂解30min，13 200r／min，離心15min，將上清蛋白提取物轉(zhuǎn)移到另一潔凈Ep管，BCA法測(cè)定2種細(xì)胞蛋白提取物濃度。分別從EC9706、EC9706／CDDP各取200μg蛋白混合后，－80℃保存。

1.2.5 蛋白電泳、蛋白膠內(nèi)胰酶消化和串聯(lián)質(zhì)譜分析 為減少蛋白污染，用 NUPAGE 120g／L Bis-tris gel進(jìn)行EC9706、EC9706／CDDP混合蛋白電泳。電泳后膠體金考馬斯亮蘭染色，根據(jù)蛋白條帶染色程度，將含有蛋白的膠條分為50份，膠內(nèi)胰酶消化、電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜檢測(cè)、生物信息學(xué)分析、檢索國(guó)際蛋白質(zhì)索引（international protein index，IPI）人類(lèi)蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)，確定蛋白名稱(chēng)并計(jì)算差異表達(dá)蛋白的比值。

2 結(jié)果

2.1 EC9706／CDDP對(duì)CDDP的耐藥指數(shù)

圖1顯示了在空白對(duì)照培養(yǎng)基和含有0.25mg／L至8mg／L CDDP的RPMI1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)72h后EC9706和EC9706／COOP細(xì)胞的存活曲線，EC9706／CDDP的RI為3.23。

2.2 EC9706／CDDP耐藥相關(guān)蛋白

膠內(nèi)胰酶消化后洗脫的肽段經(jīng)電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜檢測(cè)檢測(cè)，檢索匹配IPI人類(lèi)蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)，共鑒定到1 380個(gè)蛋白。根據(jù)我們研究確定的選取耐藥相關(guān)蛋白標(biāo)準(zhǔn)，即差異倍數(shù)大于2并檢測(cè)到每個(gè)候選蛋白的2個(gè)以上非重復(fù)的特異肽段。我們研究共鑒定出耐藥相關(guān)的74種差異表達(dá)蛋白，包括53種蛋白的表達(dá)在EC9706／CDDP升高，21種蛋白表達(dá)降低。表1顯示了在EC9706／CDDP中表達(dá)升高的前10種蛋白，表2顯示了在EC9706／CDDP中表達(dá)降低的前10種蛋白。

2.3 蛋白功能分類(lèi)

經(jīng)GO分類(lèi)分析表明，差異表達(dá)的蛋白質(zhì)分子主要包括細(xì)胞骨架相關(guān)蛋白（20%）、能量代謝相關(guān)蛋白（11%）、轉(zhuǎn)錄調(diào)控及DNA修復(fù)相關(guān)蛋白（11%）、氧化還原內(nèi)穩(wěn)態(tài)維持類(lèi)蛋白（9.5%）、蛋白合成及參與mRNA處理類(lèi)蛋白（12%）、核糖體結(jié)構(gòu)類(lèi)蛋白（8.1%）、分子伴侶蛋白（8.1%）、免疫／炎癥反應(yīng)相關(guān)蛋白（5.4%）、細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)功能相關(guān)蛋白（5.4%）、核組裝相關(guān)蛋白（2.7%）等。

圖1 EC9706和EC9706／CDDP在不同濃度CDDP的RPMI1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)72h后細(xì)胞存活曲線

表1 EC9706／CDDP中高表達(dá)的前10種蛋白

表2 EC9706／CDDP中低表達(dá)的前10種蛋白

3 討論

CDDP是臨床上較常用的化療藥物，常與其他化療藥物聯(lián)合應(yīng)用。CDDP對(duì)細(xì)胞周期的毒性作用具有非特異性，所以抗癌譜廣，可抑制DNA的復(fù)制、RNA轉(zhuǎn)錄、蛋白質(zhì)翻譯而引起細(xì)胞死亡［7］。然而，腫瘤細(xì)胞天然的或在腫瘤化療過(guò)程中獲得的耐藥性，導(dǎo)致藥物到達(dá)靶部位的濃度降低，或腫瘤細(xì)胞內(nèi)解毒系統(tǒng)、DNA損傷修復(fù)能力及抗凋亡系統(tǒng)能力的增強(qiáng)，最終化療失?。?］。

以往探討CDDP耐藥分子機(jī)制的研究多集中于DNA或RNA水平，但是這些基因或轉(zhuǎn)錄分子事件的發(fā)生與蛋白表達(dá)缺乏相對(duì)應(yīng)關(guān)系，客觀上需要在蛋白水平探討CDDP耐藥機(jī)制。蛋白質(zhì)組學(xué)是后基因組時(shí)代的一門(mén)新學(xué)科，是在蛋白質(zhì)水平上定量、動(dòng)態(tài)、整體性地研究生物體。它旨在闡明生物體全部蛋白質(zhì)的表達(dá)模式及功能模式，其內(nèi)容包括蛋白質(zhì)的定性鑒定、定量檢測(cè)、細(xì)胞內(nèi)定位、相互作用研究等，最終揭示蛋白質(zhì)功能，是基因組DNA序列與基因功能之間的橋梁。SILAC是在細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中利用穩(wěn)定同位素標(biāo)記氨基酸結(jié)合質(zhì)譜技術(shù)對(duì)蛋白表達(dá)進(jìn)行定量分析的一種新技術(shù)，不僅可以對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行定性分析，還可精確定量，具有樣本需求量少、操作簡(jiǎn)單、直接、高效等特點(diǎn)。我們以順鉑誘導(dǎo)的耐藥食管鱗癌細(xì)胞系EC9706／CDDP及其來(lái)源的敏感母細(xì)胞系EC9706為對(duì)象，采用SILAC和串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)比較2種細(xì)胞蛋白表達(dá)譜的差異，尋找食管鱗癌耐藥相關(guān)蛋白，結(jié)果鑒定出差異2倍以上74種與食管鱗癌耐藥相關(guān)蛋白，按照功能分類(lèi)，這些蛋白歸屬為10個(gè)家族。74種差異表達(dá)的蛋白包括在EC9706／CDDP中表達(dá)升高的53種及表達(dá)降低的21種蛋白。

綜上所述，我們應(yīng)用SILAC和質(zhì)譜鑒定蛋白技術(shù)，定量分析了EC9706／CDDP和EC9706的差異表達(dá)蛋白，并鑒定74種與食管癌CDDP耐藥相關(guān)的差異表達(dá)的蛋白質(zhì)分子。這些蛋白質(zhì)分別屬于不同的家族，具有多種生物學(xué)功能，表明腫瘤耐藥是涉及多種代謝環(huán)節(jié)、多個(gè)信號(hào)傳導(dǎo)通路紊亂的復(fù)雜過(guò)程，而這些差異蛋白在CDDP耐藥中的具體生物學(xué)功能及分子機(jī)制，我們正在進(jìn)行更深入的研究來(lái)證實(shí)。這些蛋白對(duì)進(jìn)一步闡明多藥耐藥的分子機(jī)制具有重要理論意義，并為逆轉(zhuǎn)多藥耐藥表型的藥物設(shè)計(jì)提供了新的分子靶點(diǎn)。

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