RP-HPLC法測定不同溶劑和緩沖溶液中羥基喜樹堿的溶解度

蒲曉輝，孫 進(jìn)，秦一萌，廉 鶴，何仲貴＊

（1.河南大學(xué)藥學(xué)院 藥物分析教研室，河南 開封475004；2.沈陽藥科大學(xué) 藥學(xué)院，遼寧 沈陽110016）

羥基喜樹堿（Hydroxycamptothecin，HCPT）是中國特有珙桐科旱蓮屬落葉植物喜樹（Camptotheca acuminata）中含有的一種生物堿。上世紀(jì)六十年代，Wall等［1］首先從喜樹中分離出具有抗腫瘤活性的喜樹堿（Camptothecin，CPT）和 HCPT。20世紀(jì)70年代初期，CPT以水溶性鈉鹽的形式進(jìn)入臨床研究，對(duì)肝癌、胃癌、膀胱癌及白血病有較好的近期療效，但因伴有嚴(yán)重的副作用（消化道反應(yīng)，血尿，白細(xì)胞及血小板減少）使得Ⅱ期臨床無法繼續(xù)。1980年，Wall［2］在“喜樹堿的結(jié)構(gòu)和活性的關(guān)系”中，肯定了HCPT是所有天然存在或合成的CPT類似物中活性最高的，而毒性比CPT低。喜樹堿類藥物的抗腫瘤活性主要通過作用于Topo I，抑制DNA的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄，進(jìn)而使細(xì)胞出現(xiàn)程序性凋亡和死亡。癌細(xì)胞中Topo I含量比正常細(xì)胞高得多，Topo I更易受到抑制，從而可以達(dá)到殺死癌細(xì)胞的目的［3－6］。HCPT是一種由五個(gè)環(huán)組成的化合物，其中有一端為六元環(huán)內(nèi)酯，此內(nèi)脂環(huán)的20（S）比20（R）抗癌活性大10～100倍，但該內(nèi)酯環(huán)遇堿不穩(wěn)定，易水解開環(huán)，抗癌活性降低。HCPT沒有明顯的堿性，屬于中性生物堿，不溶于酸，遇酸不易成鹽，不溶于水，難溶于脂，微溶于無水乙醇、甲醇，可溶于堿、吡啶、二甲亞砜、氯仿－甲醇混合液等有機(jī)溶劑。

我們建立了適用于羥基喜樹堿理化性質(zhì)研究的高效液相分析方法，首次對(duì)羥基喜樹堿在不同溶劑和不同pH值的磷酸鹽緩沖溶液中的溶解度進(jìn)行了考察，為羥基喜樹堿新型制劑的處方設(shè)計(jì)、工藝研究和穩(wěn)定性考察提供了參考。

1 試藥與儀器

1.1 試藥

羥基喜樹堿（湖北黃石飛云制藥，純度＞99%）；甲醇（色譜純，天津康科德化學(xué)試劑廠）；其余試劑均為分析純。

1.2 儀器

紫外分光光度儀（UV-1801，日本島津公司）；高效液相色譜儀 （L-7000，日本Hitachi公司，帶有自動(dòng)進(jìn)樣器、紫外檢測器）；電子分析天平（FA2104，上海精密科學(xué)儀器有限公司）；PHS-2C型精密酸度計(jì)（上海雷磁儀器廠）；HZQ-C空氣浴振蕩機(jī)（哈爾濱市東聯(lián)電子技術(shù)開發(fā)有限公司）；TGL-16B離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠）；XW-80A渦旋混合器（上海精科實(shí)業(yè)有限公司）。

2 實(shí)驗(yàn)方法和結(jié)果

2.1 HCPT體外分析方法的建立和確證

2.1.1 檢測波長的選擇 取一定質(zhì)量濃度的HCPT標(biāo)準(zhǔn)溶液（溶劑為甲醇），以甲醇作為空白對(duì)照，于200～400nm波長范圍內(nèi)掃描，結(jié)果見圖1。由圖可見，HCPT在266nm和384nm波長有最大吸收。為了避開末端吸收的影響，我們選擇384nm作為檢測波長。

2.1.2 色 譜 條 件［7－9］色 譜 柱：Diamonmsil-C18（4.6mm×200mm，5μm）；流動(dòng)相：甲醇-0.1mol／L磷酸鹽緩沖液（60∶40），pH＝5.0；檢測波長：384nm；流速：1.0mL／min；柱溫35℃；進(jìn)樣量：20μL。

圖1 HCPT紫外掃描圖

2.1.3 系統(tǒng)適用性實(shí)驗(yàn) 取一定質(zhì)量濃度的HCPT標(biāo)準(zhǔn)溶液，以20μL注入液相色譜儀，記錄色譜圖，見圖2。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在“2.1.2”項(xiàng)的色譜條件下，HCPT峰拖尾因子為1.272，分離度＝2.024＞1.5，色譜柱理論塔板數(shù)按HCPT計(jì)算不少于3 000。

2.1.4 HCPT內(nèi)酯型和羧酸鹽型色譜峰分離 取一定質(zhì)量濃度的HCPT標(biāo)準(zhǔn)溶液置25mL量瓶中，用pH6.0的磷酸鹽緩沖溶液定容至刻度，取20μL注入高效液相色譜儀，記錄色譜峰，可見HCPT的內(nèi)酯型和羧酸鹽型的2種形式可以通過HPLC有效地分離，見圖3。

圖3 內(nèi)脂環(huán)和羧酸鹽形式的HPLC色譜圖Ⅰ：羧酸鹽；Ⅱ：內(nèi)脂環(huán)。

2.1.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 取HCPT原藥2.53mg，精密稱量，置100mL棕色量瓶中，用適量甲醇溶解并稀釋定容至刻度，搖勻，得儲(chǔ)備液。精密量取10mL儲(chǔ)備液至25mL量瓶中，用適量甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得質(zhì)量濃度為10.12mg／L的標(biāo)準(zhǔn)溶液。分別精密量取該標(biāo)準(zhǔn)溶液適量，置于10mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，得到0.050 6、0.101 2、0.202 4、0.506 0、1.012 0、2.024 0mg／L的標(biāo)準(zhǔn)系列溶液，分別吸取各標(biāo)準(zhǔn)溶液20μL注入高效液相色譜儀，記錄峰面積。以HCPT質(zhì)量濃度X（mg／L）為橫坐標(biāo)，峰面積Y為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得HCPT的線性回歸方程為：Y＝9 583.7 X＋368.3，r2＝0.999 9。結(jié)果表明，在0.050 6～10.120 0mg／L范圍內(nèi)HCPT質(zhì)量濃度和峰面積呈良好的線性相關(guān)性，標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖4。

圖4 HCPT的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖

2.1.6 精密度實(shí)驗(yàn) 取質(zhì)量濃度為1.012mg／L的HCPT標(biāo)準(zhǔn)溶液5份，分別在日內(nèi)和日間重復(fù)測定，考察精密度，結(jié)果見表1。

表1 HCPT的精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果（n＝5）

2.1.7 回收率實(shí)驗(yàn) 精密量取空白納米混懸液1mL，加入HCPT儲(chǔ)備液適量，用甲醇稀釋至質(zhì)量濃度分別為0.1、1、5mg／L，進(jìn)樣測定峰面積，按標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算回收率，結(jié)果見表2。

表2 HCPT的回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果（n＝5）

2.2 HCPT在不同溶劑中的平衡溶解度測定

根據(jù)不同制備工藝的要求，選擇低毒性的有機(jī)溶劑作為溶劑，測定平衡溶解度。各種溶劑分別取2mL置于10mL具塞玻璃試管中，然后加入過量的HCPT，置水浴恒溫振蕩器中，在25℃、150次／min的條件下，振蕩72h，離心，取上清液1mL，用適量的流動(dòng)相稀釋，以“2.1.2”項(xiàng)下的色譜條件，取各溶液20μL注入高效液相色譜儀，記錄峰面積［10］。由回歸方程計(jì)算濃度，并求算HCPT的平衡溶解度，結(jié)果見表3。

2.3 HCPT在不同pH值緩沖溶液中的平衡溶解度

HCPT在其水溶液中以閉環(huán)的內(nèi)酯和開環(huán)的羧酸鹽2種形式共存，二者之間存在著一個(gè)pH值依賴的平衡關(guān)系，隨著堿性的增強(qiáng)，閉環(huán)的內(nèi)酯轉(zhuǎn)向開環(huán)的羧酸鹽，見圖5。HCPT內(nèi)酯形式在水中的溶解度遠(yuǎn)小于羧酸鹽形式，因此，隨著pH值的變化，2種形式在水中溶解度的總和也隨著變化。這一性質(zhì)不僅影響著制備工藝的選擇，而且也影響到藥物在胃腸道內(nèi)的吸收和轉(zhuǎn)運(yùn)，進(jìn)一步影響藥物的療效。所以，研究HCPT在不同pH值緩沖溶液中的平衡溶解度，可以為制備工藝的選擇和處方設(shè)計(jì)提供依據(jù)。

表3 HCPT在不同溶劑中的平衡溶解度

圖5 HCPT的內(nèi)酯環(huán)和羧酸鹽形式的互變方程式

取2mL不同pH值緩沖溶液各3份，置于10mL具塞玻璃試管中，然后加入過量的HCPT，置于水浴恒溫振蕩器中，在25℃、150次／min的條件下，振蕩72h，然后經(jīng)15 000r／min離心10min，上清液經(jīng)0.1μm膜濾過，取續(xù)濾液0.5mL，用適量的體積分?jǐn)?shù)為0.1%的醋酸甲醇溶液稀釋，以“2.1.2”項(xiàng)下的色譜條件，取各溶液20μL注入高效液相色譜儀，記錄峰面積［10］。由回歸方程計(jì)算質(zhì)量濃度，進(jìn)一步計(jì)算HCPT的平衡溶解度，結(jié)果見表4。

表4 HCPT在不同pH值緩沖溶液中的平衡溶解度

3 討論

經(jīng)繪制紫外可見吸收?qǐng)D譜，HCPT在266nm和384nm波長有最大吸收，且吸收強(qiáng)度接近。由于很多溶劑和輔料在200nm左右有明顯吸收，從而形成末端吸收，因此，對(duì)最大吸收在200nm附近的藥物的測定可能會(huì)產(chǎn)生干擾。為了避開末端吸收的影響，文中我們選擇384nm作為檢測波長，這與大多數(shù)文獻(xiàn)報(bào)道［11－13］的結(jié)果相一致。

在含 量 測 定 中，曾 選 用 流 動(dòng) 相［7－9，14－16］：乙 腈－75mmol／L醋酸銨緩沖液 （30∶70），含三乙胺5mmol／L，冰醋酸調(diào)pH 至6.4；乙腈－水（25∶75）；乙腈-75mmol／L醋酸銨緩沖溶液（25∶75），含三乙胺5mmol／L，冰醋酸調(diào)pH 至5.6；甲醇-0.1mol／L磷酸鹽緩沖液（60∶40），調(diào)pH至5.0。結(jié)果表明，前3種流動(dòng)相都使HCPT的色譜峰略有前延，且使HCPT的信號(hào)響應(yīng)值變小，這可能是因?yàn)镠CPT遇到偏堿性流動(dòng)相會(huì)部分開環(huán)，使極性增加，保留時(shí)間變短，同時(shí)使峰面積變小，從而影響含量測定的準(zhǔn)確度。

根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果可知，HCPT在大多數(shù)有機(jī)溶劑和緩沖溶液中的平衡溶解度都很低，表明HCPT的水溶性和脂溶性均較差，這可歸因于HCPT的高熔點(diǎn)、低logP值，此類物質(zhì)屬于磚灰型成分，分子間作用力強(qiáng)，結(jié)晶能高。而藥物溶出過程中涉及的活化能是影響藥物溶出的一個(gè)重要因素，對(duì)于結(jié)晶形式的藥物，只有溶解能超過其活化能（即晶格能）時(shí)，藥物才能溶出，因此，像HCPT這樣的高熔點(diǎn)、低logP值的藥物一般平衡溶解度低，屬于不溶于水，難溶于脂類化合物。

HCPT的化學(xué)結(jié)構(gòu)中存在1個(gè)羥基和1個(gè)內(nèi)酯環(huán)，在其水溶液中以閉環(huán)的內(nèi)酯和開環(huán)的羧酸鹽2種形式共存。在強(qiáng)堿環(huán)境下，內(nèi)酯環(huán)都可能開環(huán)轉(zhuǎn)向羧酸鹽形式，其平衡溶解度隨著pH值的變化而變化。根據(jù)不同pH值緩沖溶液中的HCPT平衡溶解度的測定結(jié)果可知，HCPT的平衡溶解度基本上隨著堿性的增強(qiáng)而提高，在pH 3.0時(shí)平衡溶解度最低，pH1.2時(shí)HCPT的平衡溶解度比pH 5.0、pH 6.0、pH 6.8時(shí)要高，從這一點(diǎn)我們可以推測，當(dāng)HCPT在胃中達(dá)到飽和時(shí)，進(jìn)入腸道后可能會(huì)因過飽和而沉淀析出［17］。所以，不同pH值緩沖溶液中的HCPT平衡溶解度的測定結(jié)果，為我們?cè)O(shè)計(jì)HCPT口服制劑的處方和工藝提供了有力的依據(jù)。

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