巴豆不同給藥方式對(duì)荷瘤小鼠的影響

李佳桓，林海紅，杜鋼軍

（河南大學(xué)藥學(xué)院 藥物研究所，河南 開(kāi)封475004）

癌毒，是引發(fā)惡性腫瘤的一個(gè)重要因素，其致病暴戾，毒陷邪深，非攻不克，故中醫(yī)常采用以毒攻毒之法，選用藥性劇烈的中藥，以達(dá)到攻堅(jiān)蝕瘡、破瘀散結(jié)之目的［1］。巴豆為大戟科植物巴豆（Croton tiglium L.）的干燥成熟種子，其味辛，性熱，大毒，歸胃、大腸、肺經(jīng)［2］。本實(shí)驗(yàn)制備不同的巴豆制品，采用Lewis肺癌皮下移植模型和4T1乳腺癌肺轉(zhuǎn)移模型觀察了巴豆不同給藥方式對(duì)荷瘤小鼠的影響。

1 材料

1.1 動(dòng)物及瘤株

C57BL／6小鼠及 BALB／c小鼠，雌性，18～22g，購(gòu)自河南省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心；Lewis肺癌，本實(shí)驗(yàn)室C57BL／6小鼠在體傳代保存；4T1乳腺癌，本實(shí)驗(yàn)室BALB／c小鼠在體傳代保存。

1.2 藥品與試劑

巴豆（購(gòu)自開(kāi)封同濟(jì)堂，經(jīng)中藥學(xué)許文淵教授鑒定）；印度墨汁（北京篤信精細(xì)制劑廠）；L-腎上腺素（1mg／支，重慶迪康長(zhǎng)江制藥有限公司）；谷胱甘肽（GSH，北京欣經(jīng)科生物試劑有限公司）；二硫?qū)Χ趸郊姿幔―TNB，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；辣根過(guò)氧化物酶（HRP，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；硫代巴比妥酸（TBA，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；其他試劑均為市售分析純。

1.3 巴豆霜及水煎液的制備

巴豆霜：稱取巴豆20g，去皮，粗紙包裹，電熱板上烘熱，壓榨去油，換紙后再烘再榨，反復(fù)數(shù)次，直至紙無(wú)油痕，藥物呈松散粉末狀，口服給藥時(shí)以所需劑量加入淀粉糊制成所需混懸液。水煎液：稱取巴豆20g，加水500mL煎煮2次，每次40min，合并2次煎煮液濃縮至200mL，過(guò)濾，4℃保存?zhèn)溆茫诜o藥時(shí)根據(jù)給藥劑量用蒸餾水稀釋。

1.4 儀器

ELX800UV型酶標(biāo)儀（美國(guó)Bio-Tek公司）；SB-3C-1A型潔凈工作臺(tái)（上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠）；TDL-50B型臺(tái)式離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠）；JY1001型電子天平（上海精密科學(xué)儀器有限公司）；FA1004N型分析天平（上海精密科學(xué)儀器有限公司天平儀器廠）；SK-1快速混勻器（常州國(guó)華電器有限公司）；85-2恒溫磁力攪拌器（常州國(guó)華電器有限公司）；游標(biāo)卡尺。

2 方法

2.1 對(duì)小鼠Lewis肺癌皮下移植腫瘤的影響

取生長(zhǎng)良好的lewis肺癌傳代實(shí)體瘤組織，用組織勻漿器制備單細(xì)胞懸液，調(diào)細(xì)胞數(shù)5×106／mL，按0.2mL／只接種于小鼠右前肢腋部皮下。將30只接種腫瘤的小鼠隨機(jī)分為3組，每組10只。對(duì)照組：蒸餾水0.4mL／只灌胃給藥；巴豆霜組：巴豆霜混懸液50mg／kg灌胃給藥；水煎液組：水煎液50mg／kg灌胃給藥。1次／d，連續(xù)3周，每日監(jiān)測(cè)小鼠體質(zhì)量。腫瘤長(zhǎng)出后隔日用游標(biāo)卡尺測(cè)量腫瘤直徑2次，計(jì)算腫瘤體積。治療結(jié)束次日，將小鼠處死，剝離腫瘤、脾臟，稱重，計(jì)算抑瘤率和脾臟指數(shù)。

腫瘤體積（mm3）＝腫瘤長(zhǎng)度×腫瘤寬度×腫瘤寬度／2；抑瘤率＝（1－T／C）×100%；脾臟指數(shù)＝脾臟質(zhì)量（mg）／體質(zhì)量（g）。公式中：C為對(duì)照組平均瘤重（g）；T 為實(shí)驗(yàn)組平均瘤重（g）。

2.2 對(duì)小鼠4T1乳腺癌肺轉(zhuǎn)移的影響

取生長(zhǎng)良好的4T1乳腺癌傳代實(shí)體瘤組織，用組織勻漿器制備單細(xì)胞懸液，調(diào)細(xì)胞數(shù)5×106／mL，按0.2mL／只接種于小鼠左側(cè)第二乳房墊上。將30只接種腫瘤的小鼠，隨機(jī)分為3組，每組10只。對(duì)照組：蒸餾水0.4mL／只灌胃給藥；巴豆霜組：巴豆霜混懸液50mg／kg灌胃給藥；水煎液組：水煎液50mg／kg灌胃給藥。1次／d，連續(xù)3周，每日監(jiān)測(cè)小鼠體質(zhì)量。治療結(jié)束次日，剝離肺臟，用10倍放大鏡計(jì)數(shù)肺轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)數(shù)。剝離脾臟，稱重，計(jì)算脾臟指數(shù)。

2.3 對(duì)荷4T1乳腺癌小鼠碳粒廓清能力的影響

腫瘤接種、分組給藥方法同4T1乳腺癌模型。每日測(cè)小鼠體質(zhì)量，治療結(jié)束次日，從小鼠眶靜脈采血20μL，吹入體積分?jǐn)?shù)0.1%NaHCO32mL中，以等容量小鼠正常血溶于體積分?jǐn)?shù)0.1%NaHCO3 2mL作為空白對(duì)照，用ELX 800型酶標(biāo)儀630nm處測(cè)吸光度（A），計(jì)算廓清指數(shù)K及吞噬系數(shù)α。

廓清指數(shù)K＝（logA1－logA2）／（T2－T1）；吞噬分別為1min和10min吸光度，T1、T2分別為1min、10min。

2.4 對(duì)荷瘤小鼠體內(nèi)抗氧化酶及脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物形成的影響

2.4.1 血清中SOD的測(cè)定 采用腎上腺素法，原理是腎上腺素在堿性溶液中自氧化產(chǎn)生的腎上腺素紅在480nm有吸收峰，SOD能抑制腎上腺素自氧化，腎上腺素自氧化減少的程度代表SOD酶的活性。

2.4.2 血清中GSH-PX的測(cè)定 采用DTNB法，原理是谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（GSH-PX）可以促進(jìn)H2O2與還原型谷胱甘肽（GSH）反應(yīng)生成水及氧化型谷胱甘肽（GSSG），而GSH可以和二硫代二硝基苯甲酸（顯色劑DTNB）作用生成5-硫代二硝基苯甲酸陰離子，呈現(xiàn)較穩(wěn)定的黃色，在412nm有最大吸收峰，以GSH消耗程度代表GSH-PX酶活性。

2.4.3 血清中H2O2的測(cè)定 在辣根過(guò)氧化物酶（HRP）存在下，酚紅被過(guò)氧化氫氧化后顏色由紅變黃，當(dāng)pH升至12.5左右時(shí)，黃色變?yōu)樽霞t色，可保持較長(zhǎng)時(shí)間不變，于490nm測(cè)OD值。

2.4.4 血清中MDA的測(cè)定 采用TBA法，原理是過(guò)氧化脂質(zhì)降解產(chǎn)物中的丙二醛（MDA）可與硫代巴比妥酸（TBA）縮合，形成紅色產(chǎn)物，在532nm處有最大吸收峰。

2.5 統(tǒng)計(jì)方法

用SPSS 11.0軟件進(jìn)行分析。計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩樣本均數(shù)比較采用t檢驗(yàn)，P＜0.05，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 對(duì)小鼠Lewis肺癌皮下移植腫瘤及免疫器官的影響

巴豆霜灌胃有抑制腫瘤生長(zhǎng)的作用，巴豆水煎液口服給藥對(duì)腫瘤生長(zhǎng)的抑制作用不明顯；與對(duì)照組比較，巴豆霜灌胃組脾臟指數(shù)增加明顯，巴豆水煎液組有增加趨勢(shì)。整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程小鼠生長(zhǎng)狀態(tài)良好，見(jiàn)表1。

3.2 對(duì)小鼠4T1乳腺癌肺轉(zhuǎn)移及免疫器官的影響

與對(duì)照組相比，巴豆霜和巴豆水煎液灌胃能明顯減少肺轉(zhuǎn)移率和轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)數(shù)，對(duì)脾臟指數(shù)無(wú)顯著影響。整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程小鼠生長(zhǎng)狀態(tài)良好，見(jiàn)表2。

3.3 對(duì)荷4T1乳腺癌小鼠碳粒廓清能力的影響

與對(duì)照組比較，巴豆霜組降低荷瘤小鼠碳粒廓清能力，巴豆水煎液組對(duì)荷瘤小鼠碳粒廓清能力有降低趨勢(shì)，二者都有增加肝臟指數(shù)趨勢(shì)，見(jiàn)表3。

3.4 對(duì)荷瘤小鼠體內(nèi)抗氧化酶及脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物形成的影響

巴豆霜和巴豆水煎液對(duì)荷Lewis肺癌小鼠有增強(qiáng)SOD及GSH-PX酶活性作用，雖然2種治療方式均引起MDA增加，但對(duì)H2O2水平無(wú)影響，見(jiàn)表4。在對(duì)荷4T1乳腺癌小鼠中，巴豆霜和巴豆水煎液抑制SOD和GSH-PX酶活性，不顯著影響 MDA和H2O2水平，見(jiàn)表5。

表1 巴豆對(duì)小鼠Lewis肺癌皮下腫瘤生長(zhǎng)的影響（ˉx±s，n＝10）

表2 巴豆對(duì)小鼠4T1乳腺癌肺轉(zhuǎn)移的影響（ˉx±s，n＝10）

表3 巴豆對(duì)荷4T1乳腺癌小鼠碳粒廓清的影響（ˉx±s，n＝10）

表4 巴豆對(duì)荷Lewis肺癌小鼠抗氧化酶的影響（ˉx±s，n＝10）

表5 巴豆對(duì)荷4T1乳腺癌小鼠抗氧化酶的影響（ˉx±s，n＝10）

4 討論

民間早已用巴豆治療腫瘤，其提取物對(duì)甲狀腺癌、胃癌、肝癌等多種腫瘤具有治療作用［3］。巴豆能緩解晚期胃癌患者癥狀，使病程進(jìn)展緩慢，病灶明顯縮小后，癌細(xì)胞能轉(zhuǎn)化為正常細(xì)胞［4］。Morales等［5］發(fā)現(xiàn)巴豆中的二萜成分可誘導(dǎo)MCF-7乳腺癌細(xì)胞凋亡。本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，巴豆霜灌胃給藥抑制實(shí)體瘤生長(zhǎng)，同濃度巴豆水煎液口服作用不明顯，但二者都能抑制腫瘤轉(zhuǎn)移，證明巴豆有抗腫瘤作用，其抗腫瘤活性與藥物處理方式有關(guān)。

脾臟是人體最大的外周免疫器官，在機(jī)體防御系統(tǒng)中，尤其在抗腫瘤免疫方面占有十分重要的地位［6］。巴豆霜或巴豆水煎液灌胃給藥均可增加脾臟指數(shù)，巴豆中可能含有刺激脾臟細(xì)胞增殖的成分，但二者均有降低荷瘤小鼠碳粒廓清能力的作用或趨勢(shì)，表明巴豆的免疫調(diào)節(jié)與其抗腫瘤活性沒(méi)有必然的聯(lián)系。實(shí)驗(yàn)中巴豆霜和巴豆水煎液對(duì)荷Lewis肺癌小鼠有增強(qiáng)SOD及GSH-PX酶活性作用，對(duì)荷4T1乳腺癌小鼠中卻抑制SOD和GSH-PX酶活性，提示巴豆的調(diào)節(jié)機(jī)體抗氧化功能作用也與其抗腫瘤活性無(wú)關(guān)。巴豆中的抗腫瘤成分和抗腫瘤機(jī)制需進(jìn)一步研究。

［1］查道成，吳立明.論藥毒與癌毒［J］.陜西中醫(yī)，2004，25（3）：267－269.

［2］萬(wàn)莉，周振海.巴豆的藥理研究進(jìn)展［J］.江蘇中醫(yī)藥，2003，24（17）：60－61.

［3］徐春，湯德元，曾智勇，等.淺談大黃和巴豆的藥理作用研究［J］.世界農(nóng)業(yè)，2007，343（11）：52－55.

［4］許冬青，王明艷，瞿融.巴豆生物堿對(duì)人胃腺癌細(xì)胞SGC-7901Fas基因表達(dá)影響的研究［J］.中醫(yī)藥學(xué)報(bào)，2005，33（2）：9－10.

［5］Morales A，Perez P，Mendoza R.Cytotoxic and proapoptotic activity of ent-16β-17α-dihydroxykaurane on human mammary carcinoma cell line MCF-7［J］.Cancer Lett，2005，218（1）：109－116.

［6］姜從橋.如何看待脾臟的抗腫瘤功能［J］.中華普通外科學(xué)文獻(xiàn)，2008，2（6）：444－445.