HPLC法測(cè)定杜仲粗皮及杜仲中松脂醇二葡萄糖苷的含量

吳慧敏，孔 軍，杜紅巖，李 欽＊

（1.河南大學(xué) 中藥研究所，河南 開封475004；2.河南大學(xué) 學(xué)生處，河南 開封475001；3.中國(guó)林業(yè)科學(xué)研究院 經(jīng)濟(jì)林研究開發(fā)中心，河南 鄭州450003）

杜仲為杜仲科植物杜仲（Eucommia ulmoides Oliv.）的干燥樹皮。我國(guó)第一部藥學(xué)專著《神農(nóng)本草經(jīng)》將其列為上品，具有補(bǔ)肝腎、強(qiáng)筋骨、降血壓等功效，尤其是對(duì)高血壓具有獨(dú)特的療效，是理想的天然降壓 藥 物［1－2］。松 脂 醇 二 葡 萄 糖 苷 （pinoresinol diglucoside，PDG）為杜仲主要降壓成分之一［3－8］。杜仲的加工方法［9－10］：每年4～6月剝?nèi)?，刮去粗皮，堆置“發(fā)汗”至內(nèi)皮呈紫褐色，曬干。松脂醇二葡萄糖苷在杜仲樹皮中的分布，未見報(bào)道。根據(jù)杜仲樹皮的形態(tài)特點(diǎn)（樹皮開裂狀況），把杜仲分為4種變異類型，即深縱裂型、淺縱裂型、龜裂型和光皮型［11－12］，4種變異類型中粗皮所占的比例，會(huì)影響藥材質(zhì)量。

為了搞清杜仲加工過程中刮去粗皮的合理性，我們采用HPLC法測(cè)定杜仲4種變異類型粗皮及杜仲中松脂醇二葡萄糖苷的含量，并比較了4種變異類型杜仲粗皮所占的比例，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

LC-2010A 高效液相色譜儀（日本島津）；CLASS-VP數(shù)據(jù)處理工作站；AG135型電子分析天平（METTLER TOLEDO 公司）；Diamonsil-C18色譜柱（5μm，150mm×4.6mm）。甲醇為色譜純；水為高純水；其余所用試劑均為分析純；松脂醇二葡萄糖苷對(duì)照品（中國(guó)藥品生物制品鑒定所提供，供含量測(cè)定用，批號(hào)：111537-200501）。

4種變異類型杜仲（深縱裂型、淺縱裂型、龜裂型和光皮型）均采自河南省嵩縣閆莊鄉(xiāng)中國(guó)林科院杜仲種植基地（4～6月剝?nèi)?2a生的杜仲干皮，刮去粗皮，堆置“發(fā)汗”至內(nèi)皮呈紫褐色，曬干）；光皮型杜仲分別采自河南商丘、河南鶴壁、湖北鄖西、河南靈寶（6月中旬剝?nèi)?2a生的杜仲干皮，刮去粗皮，堆置“發(fā)汗”至內(nèi)皮呈紫褐色，曬干）；杜仲粗皮為以上4種變異類型杜仲刮下的粗皮（主要為木栓層），干燥，即得。

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液的制備

2.1.1 對(duì)照品溶液的配制 精密稱取松脂醇二葡萄糖苷對(duì)照品2.47mg，甲醇溶解配制成質(zhì)量濃度為0.494g／L對(duì)照品溶液，即得。

2.1.2 供試品溶液的制備［4］選擇4種變異類型杜仲，將不同產(chǎn)地的杜仲皮的粗皮刮下，粗皮、杜仲分別粉碎。分別取樣品2g，精密稱定，置索氏提取器中，加入三氯甲烷適量，加熱回流6h，棄去三氯甲烷，藥渣揮去三氯甲烷，再置索氏提取器中，加入甲醇適量，加熱回流6h，提取液回收甲醇至適量，轉(zhuǎn)移至10mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.2 色譜條件

色 譜 柱：Diamonsil-C18柱 （5μm，150mm ×4.6mm）；流 動(dòng) 相：甲 醇－水 （23∶77）；流 速：1.0mL／min；柱溫：室溫；檢測(cè)波長(zhǎng)：277nm；進(jìn)樣量：5μL。在該色譜條件下，松脂醇二葡萄糖分離度良好，不受藥材中雜質(zhì)的干擾，結(jié)果分別見圖1、圖2、圖3。

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線及線性范圍

分別精密吸取松脂醇二葡萄糖苷對(duì)照品溶液（0.496g／L）1、2、4、6、8、10μL溶液，注入液相色譜儀中，測(cè)定色譜峰面積，以松脂醇二葡萄糖苷的進(jìn)樣量（X）為橫坐標(biāo)，峰面積（Y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得 回 歸 方 程：Y ＝535 616 X ＋25 303，r＝0.999 9。結(jié)果表明，松脂醇二葡萄糖苷在0.496～4.960μg范圍內(nèi)，進(jìn)樣量與其色譜峰面積成良好的線性關(guān)系。

2.4 精密度實(shí)驗(yàn)

精密吸取松脂醇二葡萄糖苷標(biāo)準(zhǔn)品溶液適量，連續(xù)5次進(jìn)樣，記錄峰面積，計(jì)算RSD為1.38%，n＝5。

2.5 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

取同一批光皮型（河南商丘）杜仲粉末約2g，精密稱定，按“2.1.2”方法制備供試品溶液，分別于0、2、4、6、8、10h進(jìn)樣5μL，測(cè)定，松脂醇二葡萄糖苷峰面積積分值RSD為1.58%，表明樣品溶液中松脂醇二葡萄糖苷在10h內(nèi)穩(wěn)定。

圖1 松脂醇二葡萄糖苷對(duì)照品溶液HPLC圖譜

圖2 杜仲樣品溶液HPLC圖譜

圖3 杜仲粗皮樣品溶液HPLC圖譜

表1 加樣回收率測(cè)定結(jié)果

2.6 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)

取同一批光皮型（河南商丘）杜仲粉末約2g，6份，精密稱定，分別按“2.1.2”方法制備供試品溶液，進(jìn)樣5μL，記錄峰面積，計(jì)算松脂醇二葡萄糖苷的含量，RSD值為1.5%。

2.7 回收率實(shí)驗(yàn)

取同一批（河南商丘）已知含量的光皮型杜仲粉末約1g，6份，精密稱定，分別加入一定濃度的PDG對(duì)照品適量，按照“2.1.2”項(xiàng)下供試品制備方法制備供試品溶液，并分別進(jìn)行測(cè)定，測(cè)定峰面積，計(jì)算回收率。結(jié)果表明，本方法的回收率符合要求，見表1。

2.8 樣品測(cè)定

分別精密稱取不同產(chǎn)地光皮型杜仲及粗皮各2g，按照“2.1.2”制備供試品溶液，按前述色譜條件測(cè)定，結(jié)果見表2。分別精密稱取4種變異型杜仲及粗皮各2g，按照“2.1.2”制備供試品溶液，按前述色譜條件測(cè)定，結(jié)果見表3。

表2 不同產(chǎn)地光皮型杜仲及粗皮中松脂醇二葡萄糖苷含量（n＝3）

表3 不同變異型杜仲及粗皮中松脂醇二葡萄糖苷含量（n＝3）

2.9 不同變異類型全杜仲皮中杜仲和粗皮的測(cè)定

分別稱取4種變異類型的粗皮，計(jì)算4種杜仲皮中的粗皮所占總皮的百分?jǐn)?shù)，結(jié)果見表4。

表4 不同變異類型全杜仲皮中杜仲及粗皮測(cè)定結(jié)果（n＝3）

3 討論

3.1 流動(dòng)相的選擇

參考《中國(guó)藥典》2010版一部“杜仲”項(xiàng)下含量測(cè)定方法，以甲醇－水（25∶75）為流動(dòng)相，分離效果不好。經(jīng)優(yōu)選流動(dòng)相為甲醇－水（23∶77）分離，效果較為理想。

3.2 不同產(chǎn)地光皮型全杜仲不同部位松脂醇二葡萄糖苷的含量分析

松脂醇二葡萄糖苷主要存在于去粗皮的杜仲中，河南商丘產(chǎn)光皮杜仲松脂醇二葡萄糖苷含量最高，河南鶴壁產(chǎn)光皮杜仲松脂醇二葡萄糖苷含量最低。4種產(chǎn)地光皮杜仲的粗皮松脂醇二葡萄糖苷含量檢測(cè)不到。

3.3 4種變異類型杜仲粗皮及杜仲中松脂醇二葡萄糖苷的含量分析

松脂醇二葡萄糖苷主要存在于4種變異類型的杜仲中，4種變異類型的杜仲粗皮中含量檢測(cè)不到。不同變異類型杜仲中粗皮所占重量有明顯差異，光皮型粗皮所占比例最低為6.3%，龜裂型粗皮所占比例最高為13.6%，粗皮中幾乎不含杜仲主要成分松脂醇二葡萄糖苷。以上測(cè)定結(jié)果，為中國(guó)藥典杜仲的加工方法提供了理論依據(jù)。

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