注射硫酸軟骨素酶對大鼠脊髓損傷后腓腸肌乙酰膽堿酯酶的變化及運動功能的影響①

李洪鵬，白旭東，高杰，巴方，劉寧

脊髓損傷后神經(jīng)再生和功能修復(fù)是當今醫(yī)學領(lǐng)域中的一大難題。脊髓損傷后，損傷周邊反應(yīng)性膠質(zhì)細胞增殖并分泌硫酸軟骨素蛋白聚糖(chondroitin sulfate proteoglycans,CSPGs)[1-2]，CSPGs的糖鏈可以明顯抑制軸突再生，而硫酸軟骨素酶ABC可以通過降解其糖鏈而促進中樞神經(jīng)的再生，進而促進大鼠脊髓損傷后神經(jīng)元的修復(fù)，提高肢體的運動功能[3-4]。本實驗通過制作Wistar大鼠T10脊髓損傷模型，探討硫酸軟骨素酶ABC對脊髓損傷后肢功能的恢復(fù)及肌肉組織內(nèi)乙酰膽堿酯酶的影響。

1 材料與方法

1.1 材料 硫酸軟骨素酶ChABC：美國SIGMA公司；GENMED冰凍切片乙酰膽堿酯酶活性染色試劑盒：邁新公司。成年Wistar大鼠40只，雄性，清潔級，體重250~300 g，由中國醫(yī)科大學實驗動物部提供。

1.2 動物模型制作 6%水合氯醛6 ml/kg腹腔內(nèi)注射麻醉(30 mg/kg)，背部剃毛，常規(guī)消毒，以第8~10胸椎棘突為中心行背部正中切口，縱行切開皮膚及皮下組織，剝離椎旁肌肉，暴露棘突及椎板，顯微咬骨鉗咬除第8~10胸椎棘突和椎板，暴露脊髓，約長4~5 mm，在T10節(jié)段將脊髓右側(cè)半橫斷。以大鼠的健側(cè)下肢作為對照組(A組)，患側(cè)下肢隨機分為單純脊髓損傷組(B組，n=20)及術(shù)后注射硫酸軟骨素酶ABC組(C組，n=20)。B組在脊髓橫斷后，向脊髓損傷處注入0.1 mol/L PBS 3μl；C組在脊髓橫斷后，向脊髓損傷處注入0.5 U/μl硫酸軟骨素酶ABC 3μl。縫合傷口，術(shù)后每天2次給予青霉素2×105U肌肉注射，并按摩膀胱直至排尿反射建立。動物飼養(yǎng)室溫維持在25℃~30℃。

1.3 后肢運動功能評分 各組大鼠分別于術(shù)后3 d、7 d、14 d和28 d(各5只)采用BBB評分法進行后肢運動功能評分：將動物置于面積1 m2的平面場地，自由活動4 min，由2名熟悉BBB評分標準的非本組實驗人員觀察，記錄動物后肢運動情況，取平均值。

1.4 取材與標本制作 各組大鼠分別于BBB評分后取材。6%水合氯醛6 ml/kg腹腔內(nèi)注射麻醉(30 mg/kg)，生理鹽水及4%多聚甲醛300 ml灌注固定30 min，游離并切取大鼠腓腸肌。4%多聚甲醛固定12 h，放入30%蔗糖磷酸緩沖液1~2 d，OTC包埋后在-20℃恒溫箱內(nèi)行冠狀連續(xù)冰凍切片。切片厚10 μm。

1.5 AChE染色 應(yīng)用GENMED冰凍切片乙酰膽堿酯酶活性染色試劑盒對標本進行染色：冰凍切片用清理液略洗，加工作液，入37℃培養(yǎng)箱孵育2 h，避免光照，再用清理液清洗1次，GENMED蘇木素復(fù)染試劑盒-GMS80067進行復(fù)染，中性樹脂封片，即刻在光學顯微鏡下觀察。

1.6 AchE活性分析 應(yīng)用MetaMorph/OP10/BX41圖像分析系統(tǒng)采集圖像并分析AchE染色陽性光密度值(OD值)。

2 結(jié)果

2.1 BBB評分 所有動物在術(shù)前評分均為21分；術(shù)后即刻各組動物健側(cè)運動功能短暫降低后，很快恢復(fù)到21分，患側(cè)損傷后BBB評分為0。B組和C組均與A組有顯著性差異(P<0.01)。隨著時間的延長，B組與C組大鼠的BBB評分有增高的趨勢，總的評分有非常高度顯著性差異(F=531.275,P=0.000)。術(shù)后14 d、28 d，C組BBB評分均優(yōu)于B組(P<0.05)。見表1。

2.2 腓腸肌內(nèi)AChE的表達 各組大鼠健側(cè)腓腸肌運動終板區(qū)AchE為棕黑色、細顆粒狀亞鐵氰化銅沉淀，在冠狀切面上呈橢圓形或卵圓形，大小20~40μm，邊緣清晰(圖1)。而B組(圖2)和C組(圖3)腓腸肌運動終板區(qū)AchE陽性顆粒形狀多不規(guī)則，且面積較小，尤以7 d、14 d、28 d下降顯著。

圖像分析顯示：A組(健側(cè))各時間段AChE的OD值無顯著性差異。而B組及C組OD值在損傷后與健側(cè)比較均明顯下降(P<0.01)，以B組下降更明顯。C組在損傷后14 d及28 d較B組有顯著性差異(P<0.05)。見表2。

表2 各組術(shù)后不同時間AChE的平均光密度

3 討論

脊髓損傷的病理生理機制非常復(fù)雜，近年來對脊髓損傷后微環(huán)境中的抑制因子研究較多。CSPGs在中樞神經(jīng)發(fā)育過程中可調(diào)節(jié)神經(jīng)細胞增生、遷徙、分化，軸突的生長和路徑選擇，以及突觸的形成和成熟[4]。脊髓損傷后，CSPGs的堆積可抑制神經(jīng)細胞軸突的再生修復(fù)[5]。CSPGs是帶有多種糖鏈的蛋白聚糖，而對神經(jīng)再生起抑制作用的主要因素是其糖鏈，因此本研究采用可以消化CSPGs葡胺聚糖鏈的ChABC。

BBB評分是由Basso等提出的一種脊髓運動功能評定法，用于評價大鼠脊髓損傷后肢體運動功能的恢復(fù)情況[6]。該評分標準包括許多動物行為細節(jié)和特征說明，分級較細致(0~21分)，評分與脊髓功能恢復(fù)有良好的一致性。

AChE主要存在于突觸間隙及運動終板，它可催化乙酰膽堿，使其水解為膽堿和乙酸。各種形式的AChE都能在脊髓運動神經(jīng)元和骨骼肌細胞中找到[7]。AChE活性不僅可反映運動神經(jīng)元的功能狀態(tài)[8]，而且終板區(qū)AChE對于神經(jīng)肌肉接頭突觸功能和結(jié)構(gòu)的維持也是必需的，所以終板區(qū)AChE含量能夠反映終板退變及再生情況[9-10]。

本研究顯示，脊髓損傷后，大鼠運動功能的恢復(fù)與乙酰膽堿酯酶表達一致，提示ChABC治療可以提高脊髓損傷后大鼠的后肢功能恢復(fù)，其機制可能是促進神經(jīng)再生并修復(fù)運動終板。

ChABC治療不僅可以促進脊髓本身的神經(jīng)再生和修復(fù)，阻止神經(jīng)肌肉接頭以上的退行性改變，而且可以加強肌肉與脊髓神經(jīng)的聯(lián)系，使遠端肢體進行形態(tài)與功能重塑。但ChABC裂解CSPGs促進神經(jīng)再生的機制目前仍然未完全清楚。

目前還沒有一種方法能夠使脊髓損傷完全康復(fù)，脊髓損傷治療的研究不應(yīng)只局限于損傷局部神經(jīng)再生，更要重視遠端肌肉組織內(nèi)運動終板的研究。綜合應(yīng)用多種治療方法對恢復(fù)運動功能具有廣大的研究前景和應(yīng)用價值。

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