藥物和行為干預(yù)對缺血缺氧性腦損傷大鼠功能恢復(fù)的影響①

侯梅，楊會娟，姜艷平

缺血缺氧性腦損傷(hypoxic-ischemic brain damage,HIBD)是早產(chǎn)及低出生體重兒神經(jīng)系統(tǒng)殘疾的重要原因，嚴(yán)重影響著患兒、家庭和社會。單唾液酸神經(jīng)節(jié)苷脂(GM1)和神經(jīng)生長因子(NGF)作為神經(jīng)營養(yǎng)藥物被廣泛用于HIBD后遺癥患兒的臨床治療，其療效、用藥方法有待進一步驗證。

1 資料和方法

1.1 動物模型 選擇2日齡SD大鼠，雌雄不限。抽取7只入假手術(shù)組。其余幼鼠參照Han以及改良Rice法[1-2]制作腦室周圍白質(zhì)軟化(PVL)動物模型：分離、結(jié)扎、切斷左側(cè)頸總動脈，入自制密封艙，通入6%O2+94%N2混合氣體4 h，氧濃度范圍為(6±0.3)%。觀察模型制作后24 h大鼠活動情況，將能夠正常吮乳的48只乳鼠分為：GM1治療組、NGF治療組、藥物聯(lián)合(GM1+NGF)治療組、行為干預(yù)治療組、藥物聯(lián)合+行為干預(yù)治療組、模型對照組，每組8只。分組后，所有幼鼠由母鼠自由哺乳，單組單籠，每天更換干刨花，保持環(huán)境干燥。幼鼠在籠里自由活動，自然光環(huán)境生長。

1.2 干預(yù)措施

1.2.1 藥物干預(yù) GM1(博司捷)：黑龍江哈爾濱醫(yī)大藥業(yè)有限公司，批準(zhǔn)文號：國藥準(zhǔn)字H20060422；注射用鼠NGF(金路捷)：武漢海特生物制藥股份有限公司，批準(zhǔn)文號：國藥準(zhǔn)字S20060051。采用腹腔內(nèi)藥物注射，自4日齡開始，每日1次連續(xù)7 d。藥物治療方案見表1。對照組采用等量生理鹽水腹腔內(nèi)注射。

表1 實驗動物腹腔內(nèi)注射藥物治療方案

1.2.2 行為干預(yù) 行為干預(yù)自15日齡開始，共持續(xù)14 d。干預(yù)內(nèi)容包括：①感覺促進訓(xùn)練：用硬毛刷刷右側(cè)上下肢，按肢體長軸方向由近端至遠(yuǎn)端，加壓快速刷4個8拍，每天1次；②肢體協(xié)調(diào)性及肌力訓(xùn)練：15日齡大鼠眼睛已睜開，放置于轉(zhuǎn)籠里活動15 min/d，必要時給予夾尾刺激，使其轉(zhuǎn)籠；③游泳訓(xùn)練：放置于水深約30 cm的溫水槽(80×50×55 cm)中，水面離槽口20 cm左右，避免大鼠跳出水槽。用木棒驅(qū)趕大鼠在水中游泳10~15 min。

1.3 行為學(xué)測試 大鼠30日齡(相當(dāng)于人類2~5歲)時進行神經(jīng)行為學(xué)檢測。

1.3.1 懸吊試驗 大鼠前爪抓住一根水平懸吊的尼龍繩(直徑約0.4 cm)，尼龍繩長50 cm，離開桌面75 cm。記錄大鼠在繩上的時間。評分標(biāo)準(zhǔn)：1分：<10 s，2分：10~30 s，3分：30 s~2 min，4分：2~5 min，5分：>5 min；當(dāng)大鼠出現(xiàn)雙上肢沿繩橫走或屈曲軀干試圖使下肢抓繩時，每項另加0.5分。

1.3.2 斜坡試驗 將大鼠頭向下倒置于45°的斜面上，記錄轉(zhuǎn)頭向上>135°所需要的時間，取3次計算平均值。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件進行處理。結(jié)果以(±s)表示。對于正態(tài)分布的計量資料，用單因素方差分析(ANOVA)進行顯著性檢驗，需進行兩兩比較時，應(yīng)用q檢驗。析因設(shè)計資料采用相應(yīng)的方差分析進行比較。所有假設(shè)檢驗顯著性水平α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 生長情況 1日齡及4日齡各組大鼠體重?zé)o顯著性差異(P>0.05)。10日齡各組大鼠間體重有顯著性差異(P=0.032)，NGF組大鼠體重高于其他各組(P<0.05)，而其余各組間無顯著性差異(P>0.05)。見表2。

表2 各組大鼠體重比較(g)

2.2 懸吊實驗 除NGF組外，其他各組動物成績均高于模型對照組(P<0.05)；各實驗組成績均低于假手術(shù)組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；藥物聯(lián)合+行為干預(yù)組成績優(yōu)于GM1組、NGF組及藥物聯(lián)合組(均P<0.05)。見表3。

田歌依然冷冷地回絕：“沒什么好談的。你不走，我就走。”思雨有些生氣了。他憤憤地看了妻子一眼，然后離開了。

2.3 斜坡實驗 各治療組成績均優(yōu)于模型對照組(均P<0.05)；除藥物聯(lián)合+行為干預(yù)組外，其余各組成績均較假手術(shù)組低(均P<0.05)；行為干預(yù)組、藥物聯(lián)合+行為干預(yù)組的成績優(yōu)于GM1、NGF及藥物聯(lián)合組(均P<0.05)。見表3。

表3 各組大鼠行為學(xué)測試比較

2.4 析因設(shè)計分析

2.4.1 懸吊實驗 GM1與NGF無交互效應(yīng)(F=1.620,P=0.214)；GM1存在主效應(yīng)(F=5.185,P=0.031)，NGF無主效應(yīng)(F=2.322,P=0.139)。藥物聯(lián)合治療及行為干預(yù)無交互效應(yīng)(F=0.348,P=0.560)。藥物聯(lián)合治療(F=5.887,P=0.022)和行為干預(yù)(F=14.467,P=0.001)均存在主效應(yīng)。

2.4.2 斜坡實驗 GM1與NGF無交互效應(yīng)(F=6.546,P=0.160)； GM1(F=22.299,P=0.000)和 NGF(F=21.386,P=0.000)均存在主效應(yīng)。藥物聯(lián)合治療與行為干預(yù)存在交互效應(yīng)(F=12.241,P=0.002)，藥物聯(lián)合治療(F=25.035,P=0.000)及行為干預(yù)(F=8.548,P=0.000)均存在主效應(yīng)。

3 討論

未成熟HIBD的細(xì)胞分子學(xué)及生物化學(xué)機制包括[3]：①缺氧缺血后腦灌注及代謝的變化；②細(xì)胞毒性機制；③缺氧缺血后神經(jīng)元死亡的機制；④基因表達(dá)的改變：熱休克蛋白(heat shock proteins,HSP)生成上調(diào)，神經(jīng)營養(yǎng)因子的分泌等。

2日齡大鼠的腦組織處于少突膠質(zhì)細(xì)胞前體細(xì)胞發(fā)育時期，相當(dāng)于人類妊娠24~32周胎兒發(fā)育時期[4]。此階段出生的活產(chǎn)兒中，PVL的發(fā)生率約為2‰~4‰，且隨著出生胎齡的降低而升高[5]。

研究證實[6-8]，中樞神經(jīng)系統(tǒng)具有高度的可塑性，主要表現(xiàn)為突觸的形成、結(jié)構(gòu)及功能的調(diào)節(jié)。早期給予豐富環(huán)境、各種感覺運動刺激、神經(jīng)營養(yǎng)因子等均能夠增強神經(jīng)可塑性。GM是組成細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)和維持膜功能的基本物質(zhì)，外源性GM1能夠透過血腦屏障，嵌入膜結(jié)構(gòu)中，調(diào)節(jié)膜介導(dǎo)的細(xì)胞功能，啟動受損后潛在的代償機制，促進神經(jīng)重構(gòu)，保護未受損害的神經(jīng)組織，阻止損害進一步發(fā)展[9]。NGF不但具有促進神經(jīng)元原有軸突的出芽、分枝及生長的功能[10]，而且還能夠促進那些未長出軸突的神經(jīng)干細(xì)胞在神經(jīng)元分化過程中向極化狀態(tài)轉(zhuǎn)變，并增加生長錐的生成，增加分化后神經(jīng)元軸突的數(shù)量。

本研究通過行為學(xué)評分觀察神經(jīng)營養(yǎng)藥物對大鼠腦功能的影響，結(jié)果表明，單一藥物治療即可取得滿意結(jié)果，聯(lián)合用藥并不能增加療效。本實驗中，單純NGF治療在改善上肢肌力以及隨意運動能力(懸吊試驗)方面沒有顯示療效，原因可能與該組動物的體重增長較其他各組快，影響了懸吊實驗測試結(jié)果有關(guān)。

臨床上，運動療法是改善HIBD后遺癥患兒軀體功能最主要的治療方式。Jones對實驗動物進行了行為干預(yù)與突觸可塑性之間的相關(guān)性研究，發(fā)現(xiàn)大鼠前肢感覺運動皮質(zhì)損傷后，綜合的復(fù)雜運動技能訓(xùn)練要比重復(fù)性簡單運動更能刺激大腦皮質(zhì)突觸的發(fā)生、促進運動功能恢復(fù)[14]。行為干預(yù)能夠增強感覺輸入，改善神經(jīng)元的微環(huán)境，刺激多種神經(jīng)營養(yǎng)因子的分泌，誘導(dǎo)神經(jīng)前體細(xì)胞分裂和增殖[15-16]，從而促進損傷修復(fù)。我們的觀察顯示，單純行為干預(yù)及聯(lián)合藥物治療均能夠明顯提高實驗動物的肌力、隨意運動以及軀體的平衡和協(xié)調(diào)功能(斜坡試驗)，并存在協(xié)同效應(yīng)，證實了臨床運動療法的價值。

本實驗提示，GM1及其與NGF聯(lián)用都能夠明顯改善實驗動物的肌力和隨意運動以及軀體平衡和協(xié)調(diào)功能；對于NGF，本次實驗只發(fā)現(xiàn)了其對軀體平衡和協(xié)調(diào)功能有改善，兩者聯(lián)用較單藥治療并未表現(xiàn)出明顯優(yōu)勢，提倡單藥治療。行為干預(yù)能夠提高實驗動物的肌力和隨意運動能力、改善實驗動物的軀體協(xié)調(diào)及平衡功能，聯(lián)合藥物治療可取得協(xié)同效應(yīng)。

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