早期干預(yù)及康復(fù)訓(xùn)練對(duì)宮內(nèi)感染腦損傷仔鼠腦白質(zhì)髓鞘相關(guān)糖蛋白表達(dá)的影響②

張明達(dá)，李曉捷

腦性癱瘓(cerebral palsy,CP)是由于發(fā)育中胎兒或嬰兒腦的非進(jìn)行性損傷所致持續(xù)性運(yùn)動(dòng)和姿勢(shì)發(fā)育異常、活動(dòng)受限的一組綜合征[1]。常并發(fā)感覺(jué)、知覺(jué)、認(rèn)知、交流、行為紊亂、癲癇、繼發(fā)性肌肉與骨骼問(wèn)題。近年來(lái)，由于感染/炎癥與腦癱關(guān)系的研究取得很大的進(jìn)展，臨床與流行病學(xué)資料都證實(shí)腦室周?chē)踪|(zhì)軟化(perivetricular leukomalacia,PVL)是腦癱的一個(gè)重要危險(xiǎn)因素，而感染是導(dǎo)致PVL發(fā)生的原因[2]。大量研究證實(shí)，早期干預(yù)可通過(guò)一系列的機(jī)制促進(jìn)腦損傷鼠的神經(jīng)行為學(xué)改變。髓鞘相關(guān)糖蛋白(myelin-associated glycoprotein,MAG)是免疫球蛋白超家族成員，是中樞神經(jīng)系統(tǒng)和外周神經(jīng)系統(tǒng)中的一種髓鞘成分，并與中樞神經(jīng)系統(tǒng)的損傷關(guān)系密切[3]。它參與髓鞘的形成和維持并且在軸突生長(zhǎng)方面起到重要作用。本研究應(yīng)用免疫組化技術(shù)對(duì)早期干預(yù)后腦組織中MAG含量變化和運(yùn)動(dòng)功能改善情況進(jìn)行相關(guān)性研究，從形態(tài)學(xué)、分子生物學(xué)和行為學(xué)方面揭示先天性腦損傷及功能恢復(fù)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 清潔級(jí)雌性Wistar大鼠40只，體重220~250 g，雄性10只，體重250~300 g：大連醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心；脂多糖(lipopolysaccharides,LPS)，血清型055：B5：美國(guó)SIGMA公司；細(xì)胞免疫組化法(SABC法)試劑盒、兔抗鼠MAG多克隆抗體：北京博奧森生物工程有限公司。

1.2 動(dòng)物模型制備與分組 Wistar大鼠室溫(21±1)℃下常規(guī)飼養(yǎng)，自由飲食，適應(yīng)環(huán)境2周后于17：00分兩批，每批雌鼠20只，按雌∶雄=2∶1合籠，第2天8：00查陰道涂片，如果查到精子記為妊娠0 d。孕鼠另籠飼養(yǎng)，分別在孕17 d、18 d對(duì)30只雌鼠(脂多糖組)腹腔注射脂多糖420μg/kg·d，另10只注射等量無(wú)菌生理鹽水。仔鼠出生后去除孕22 d前出生的仔鼠，取脂多糖組胎盤(pán)行HE染色，觀察宮內(nèi)感染情況，判斷標(biāo)準(zhǔn)為組織中含有大量中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)。隨機(jī)抽取脂多糖組仔鼠100只分為干預(yù)組和非干預(yù)組各50只；選取生理鹽水組仔鼠(對(duì)照組)50只。

1.3 干預(yù)方法 干預(yù)組從出生后第1天開(kāi)始進(jìn)行早期干預(yù)，2周后康復(fù)訓(xùn)練，非干預(yù)組和對(duì)照組常規(guī)飼養(yǎng)。

1.3.1 早期干預(yù) 將1日齡干預(yù)組仔鼠托至掌心，給予不同強(qiáng)度和頻率的聲音和燈光刺激，同時(shí)用毛刷從前到后均勻有力的刷動(dòng)，不能用力過(guò)大，防止產(chǎn)生疼痛。每天1次，每次20 min，持續(xù)至2周齡。

1.3.2 康復(fù)訓(xùn)練 對(duì)15日齡干預(yù)組小鼠進(jìn)行豐富環(huán)境刺激和康復(fù)訓(xùn)練。每次30 min，每天1次。豐富環(huán)境包括轉(zhuǎn)盤(pán)、階梯、管道、秋千、斜坡和不同顏色和大小的球類(lèi)等，每周改變環(huán)境兩次，持續(xù)至28日齡結(jié)束。康復(fù)訓(xùn)練包括平衡木訓(xùn)練、轉(zhuǎn)棒訓(xùn)練和轉(zhuǎn)籠訓(xùn)練等。

非干預(yù)組和對(duì)照組飼養(yǎng)于同樣大小的籠內(nèi)，但不給予干預(yù)。

1.4 運(yùn)動(dòng)功能評(píng)定 分別用懸吊實(shí)驗(yàn)[4]和改良BBB測(cè)試[5]于14 d、21 d、28 d對(duì)每組仔鼠進(jìn)行運(yùn)動(dòng)功能評(píng)定。

1.5 取材 分別于出生后第1、7、14、21、28天對(duì)3組仔鼠各取6只行麻醉下心臟灌洗后斷頭，迅速取腦組織，甲醛溶液中固定。

1.6 MAG測(cè)定 各組石蠟包埋組織切片6張，片厚5μm，其中5張行MAG免疫組化染色，1張用磷酸緩沖鹽溶液代替一抗作陰性對(duì)照。

用Image Pro Plus 4.5圖像分析軟件計(jì)數(shù)MAG表達(dá)積分光密度(IOD)。每張切片隨機(jī)選取6個(gè)位置相應(yīng)但不重復(fù)的視野均值作為該片IOD；每組選取6張切片。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。多組間比較采用單因素方差分析；組間均數(shù)比較采用t檢驗(yàn)，方差不齊時(shí)組間均數(shù)比較采用t'檢驗(yàn)。顯著性水平α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 孕鼠分娩及仔鼠一般情況 脂多糖組孕鼠注射脂多糖后，進(jìn)食及活動(dòng)均明顯減少，精神狀態(tài)較生理鹽水組明顯萎靡，其中5只死亡，4只提前分娩，其余21只順利生產(chǎn)，共娩出仔鼠128只，死產(chǎn)13只。脂多糖組仔鼠身體顏色青紫，體重低，進(jìn)食減少且精神萎靡，活動(dòng)減少。生理鹽水組注射生理鹽水后無(wú)明顯異常，共娩出仔鼠103只，均為足月活產(chǎn)鼠，反應(yīng)靈敏，顏色淡紅，體重正常。

2.2 子宮及胎盤(pán)檢測(cè) 脂多糖組孕鼠胎盤(pán)病理切片觀察見(jiàn)大量中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)，血管充血、水腫；生理鹽水組孕鼠胎盤(pán)未見(jiàn)異常。

2.3 神經(jīng)行為學(xué)檢測(cè)

2.3.1 懸吊試驗(yàn) 與對(duì)照組比較，干預(yù)組和非干預(yù)組懸吊時(shí)間短(P<0.01)；但干預(yù)組測(cè)試得分明顯高于非干預(yù)組(P<0.01)。見(jiàn)表1。

2.3.2 改良BBB測(cè)試 14與21日齡干預(yù)組和非干預(yù)組得分明顯低于對(duì)照組(P<0.01)；干預(yù)組評(píng)分明顯高于非干預(yù)組(P<0.01)；28日齡干預(yù)組與對(duì)照組評(píng)分無(wú)顯著性差異(P>0.05)，非干預(yù)組評(píng)分明顯低于對(duì)照組(P<0.01)。見(jiàn)表2。

2.4 MAG 干預(yù)組和非干預(yù)組MAG表達(dá)IOD值均明顯高于對(duì)照組(P<0.01)；7日齡以后，非干預(yù)組明顯高于干預(yù)組(P<0.01)。見(jiàn)表3。

表1 不同日齡仔鼠懸吊實(shí)驗(yàn)評(píng)分

表2 不同日齡仔鼠改良BBB評(píng)分

表3 不同日齡各組仔鼠腦白質(zhì)MAG表達(dá)情況(IOD)

3 討論

中樞神經(jīng)系統(tǒng)在受到損傷后具有一定可塑性，即殘留部分腦組織結(jié)構(gòu)和功能重建的能力，其中關(guān)鍵是軸突的再生。目前認(rèn)為中樞神經(jīng)系統(tǒng)軸突再生障礙主要有兩個(gè)原因：①損傷神經(jīng)元存在再生能力缺陷；②中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)微環(huán)境不適合其再生。其中抑制性因素被認(rèn)為可能起更重要的作用。目前發(fā)現(xiàn)的神經(jīng)再生抑制性髓鞘蛋白主要有MAG、Nogo和少突膠質(zhì)細(xì)胞糖蛋白(OMGP)，還包括很多有膠質(zhì)細(xì)胞神經(jīng)元本身產(chǎn)生的蛋白多糖和生長(zhǎng)錐抑制因子以及細(xì)胞外分子等[6]。

表1、表2顯示，生理鹽水組的運(yùn)動(dòng)功能明顯好于腦損傷組，經(jīng)過(guò)早期干預(yù)和康復(fù)訓(xùn)練的損傷組仔鼠運(yùn)動(dòng)功能提高顯著，而未經(jīng)訓(xùn)練的損傷組仔鼠運(yùn)動(dòng)功能提高不明顯。但是隨著各組仔鼠日齡增加，其運(yùn)動(dòng)功能均有提高，這說(shuō)明宮內(nèi)感染所致仔鼠腦損傷為非進(jìn)行性腦損傷；干預(yù)組仔鼠經(jīng)過(guò)早期干預(yù)和康復(fù)訓(xùn)練后運(yùn)動(dòng)功能比非干預(yù)組提高明顯，也說(shuō)明康復(fù)訓(xùn)練這種形式對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷后可塑性的提高起到了明顯促進(jìn)作用。

表3顯示，在生理鹽水組中MAG的表達(dá)量要明顯低于損傷組，說(shuō)明MAG在仔鼠出生時(shí)即有表達(dá)，在腦損傷后表達(dá)上調(diào)。干預(yù)組仔鼠表達(dá)量要低于非干預(yù)組，說(shuō)明早期干預(yù)和康復(fù)訓(xùn)練能抑制MAG的表達(dá)，從而促進(jìn)腦損傷仔鼠腦組織結(jié)構(gòu)和功能的恢復(fù)。在各組中MAG表達(dá)均是先增多后降低然后趨于穩(wěn)定，MAG在各組中均是在第7天表達(dá)達(dá)高峰，在21 d、28 d時(shí)逐漸降低。這與袁普衛(wèi)等[7]研究的MAG在急性脊髓損傷后的表達(dá)規(guī)律相一致。早期干預(yù)和康復(fù)訓(xùn)練后MAG表達(dá)減少，提示運(yùn)動(dòng)功能的提高與腦組織中MAG的表達(dá)可能具有一定的相關(guān)性。

MAG作為一種髓鞘相關(guān)抑制蛋白，能夠抑制神經(jīng)元突起的生長(zhǎng)和軸突的生長(zhǎng)而且還可能影響軸突的結(jié)構(gòu)，從而影響神經(jīng)元的功能[8]。通過(guò)以上實(shí)驗(yàn)研究，我們可以初步推論，腦損傷后，MAG在短時(shí)間內(nèi)的表達(dá)增高，阻礙了軸突和髓鞘的再生，這解釋了中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷后難以再生的部分原因，而采取干預(yù)措施后，MAG表達(dá)水平出現(xiàn)下降，這與臨床上早期干預(yù)及康復(fù)訓(xùn)練的效果相符，這表明早期干預(yù)及康復(fù)訓(xùn)練可能通過(guò)某種機(jī)制降低中樞神經(jīng)系統(tǒng)微環(huán)境中抑制因子的表達(dá)，從而改善神經(jīng)修復(fù)和再生的微環(huán)境，促進(jìn)軸突和髓鞘的形成，增強(qiáng)了中樞神經(jīng)的可塑性，這很好的解釋了臨床上通過(guò)早期干預(yù)和康復(fù)訓(xùn)練能夠改善腦癱及其中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷相關(guān)疾病癥狀的原因。

近年來(lái)對(duì)MAG的抑制作用機(jī)制的研究發(fā)現(xiàn)，神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子p75NTR在轉(zhuǎn)導(dǎo)其抑制性效應(yīng)中起到重要作用。Domeniconi等發(fā)現(xiàn)，MAG通過(guò)受控的膜內(nèi)蛋白水解作用(RIP)先后經(jīng)過(guò)α和γ分泌酶兩次對(duì)p75NTR進(jìn)行剪切，使其能釋放出胞內(nèi)區(qū)(ICD)[9]，后者正是蛋白激酶PKC和小GTP酶Rho激活所必須的，由此啟動(dòng)下游的信號(hào)來(lái)抑制軸突的生長(zhǎng)，因此如果能阻斷該分泌酶的活性就很有可能阻斷NgR與MAG結(jié)合所導(dǎo)致的軸突生長(zhǎng)抑制，這為中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷的治療提供了一個(gè)有效的靶點(diǎn)。另外，還有很多已經(jīng)被提出來(lái)的關(guān)于MAG的抑制作用的機(jī)制，但是目前仍缺少定論，所以對(duì)MAG的抑制效應(yīng)和相應(yīng)的作用機(jī)制及其信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路等方面還需要更深入的研究。

早期干預(yù)可使新生鼠皮層重量和厚度增加，神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞增生、突觸和樹(shù)突枝增多等，使受損傷腦通過(guò)產(chǎn)生非常規(guī)神經(jīng)突觸、樹(shù)突出現(xiàn)不尋常分叉、軸突繞道投射等途徑進(jìn)行功能代償[10]可以提高新生鼠GABA受體的水平，增加突觸的飽和度[11]，可以提高腦內(nèi)新環(huán)路調(diào)控的可塑性[12]。康復(fù)訓(xùn)練不但能夠促進(jìn)腦損傷功能區(qū)恢復(fù)，還可以促進(jìn)樹(shù)突發(fā)芽，技巧平衡訓(xùn)練可刺激突觸的增生，促進(jìn)大腦皮質(zhì)血管生成增多，同時(shí)能增加神經(jīng)沖動(dòng)，減輕損傷周?chē)鷧^(qū)的功能障礙，有利于腦室周?chē)踪|(zhì)損傷的修復(fù)[13]，對(duì)腦的可塑性有重要意義。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明，早期干預(yù)和康復(fù)訓(xùn)練可以明顯改善腦損傷仔鼠的運(yùn)動(dòng)功能，并且能夠減少M(fèi)AG的表達(dá)。MAG蛋白的測(cè)定不但能夠?yàn)榕R床早期診斷腦損傷提供重要的客觀依據(jù)，而且能為臨床確定最佳的檢查時(shí)間窗提供必要的依據(jù)。這也正是研究MAG在腦損傷中表達(dá)變化的意義所在[14]。

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