舒郁寧心湯對(duì)抑郁大鼠海馬Bcl-2和Bax表達(dá)的影響①

黃泉智，許成勇，孫志高，楊陽(yáng)，胡亞卓，陳利平，王發(fā)渭

抑郁癥是一種以持續(xù)情緒低落、興趣或愉快感喪失為主要癥狀的情感障礙性疾病[1]。世界衛(wèi)生組織預(yù)測(cè)，到2020年抑郁障礙將成為發(fā)展中國(guó)家最嚴(yán)重的疾病負(fù)擔(dān)，人類死亡、殘疾的第2大原因，女性死亡和殘疾的首位疾病[2]。有研究顯示，慢性應(yīng)激增加海馬神經(jīng)元凋亡，引起海馬結(jié)構(gòu)和功能的變化，參與抑郁癥的發(fā)病[3]。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)觀察抑郁模型大鼠海馬區(qū)凋亡調(diào)控蛋白Bcl-2和Bax表達(dá)的變化，探索舒郁寧心湯抗抑郁功效的可能機(jī)理。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí)雄性SD大鼠70只，體重(200±20)g，解放軍總醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，許可證編號(hào)：SLXK京2009-0007。

1.1.2 藥物 鹽酸氟西汀分散片：PATHEON FRANCE公司(批號(hào)：9711B)，20 mg/粒，蒸餾水配成濃度為0.4 mg/ml的混懸液，現(xiàn)用現(xiàn)配。舒郁寧心湯由柴胡、郁金、梔子、茯神、酸棗仁組成，解放軍總醫(yī)院中藥房鑒定提供，上藥浸泡、煎煮、過(guò)濾，于80℃恒溫水浴中濃縮至含生藥量5 g/ml藥液，4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.3 主要試劑及設(shè)備 Bcl-2多克隆抗體(批號(hào)：990785W)和Bax多克隆抗體(批號(hào)：909901W)：北京博奧森生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品；二抗顯色試劑盒：EnVision Detection Kit基因科技(上海)有限公司產(chǎn)品(Code No.GK500705)；全自動(dòng)真空脫水機(jī)(LEICA ASP300)、組織包埋機(jī)(LEICA EG1140H)、石蠟切片機(jī)(LEICA RM2135)、展片機(jī)(LEICA HI1210)：德國(guó)LEICA公司；光學(xué)顯微鏡：日本OLYMPUS BX60系統(tǒng)顯微鏡。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 動(dòng)物分組及模型建立 動(dòng)物飼喂于解放軍總醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心SPF級(jí)嚙齒類動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室，溫度20℃~24℃，噪聲≤60 dB，晝夜節(jié)律12/12 h。大鼠自由攝食和飲水，適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d后行曠場(chǎng)(open-field)試驗(yàn)進(jìn)行行為學(xué)評(píng)分，選擇得分相近的60只隨機(jī)分為6組：對(duì)照組、模型組、低劑量組、中劑量組、高劑量組、鹽酸氟西汀組，每組10只。造模方法采用孤養(yǎng)加慢性輕度不可預(yù)見(jiàn)性的應(yīng)激(chronic unpredictable mild stress,CUMS)抑郁模型[4]并稍加改進(jìn)：對(duì)照組每籠飼養(yǎng)5只，正常飲食、飲水，不予任何刺激；其余各組每籠飼養(yǎng)1只，并接受21 d慢性應(yīng)激刺激，包括禁水24 h、禁食24 h、夾尾1 min、電擊足底(20 V,1 s/次,間隔1 min,共20次)、冰水游泳(4℃,4 min)、傾斜籠子(45°,12 h)、轉(zhuǎn)換晝夜節(jié)律24 h、制動(dòng)2 h、熱刺激40℃，5 min。每天隨機(jī)安排1種刺激，每種刺激重復(fù)2~3次。

1.2.2 給藥方法 低、中、高劑量組和鹽酸氟西汀組分別按正常成人(60 kg體重)與大鼠(200 g體重)體表面積折算。對(duì)照組不灌藥，模型組每日灌胃2 ml生理鹽水，低劑量組每日灌胃含生藥0.5 g舒郁寧心中藥2 ml，中劑量組每日灌胃含生藥1.5 g舒郁寧心中藥2 ml，高劑量組每日灌胃含生藥5.0 g舒郁寧心中藥2 ml，鹽酸氟西汀組每日灌胃含鹽酸氟西汀0.4 mg/ml混懸液2 ml。造模成功后于第22天起連續(xù)給藥3周。

1.2.3 曠場(chǎng)試驗(yàn) 曠場(chǎng)裝置由不透明材料制成，底面為75×75 cm的正方形并被等分為25個(gè)正方形格，周壁高45 cm。將大鼠置于中心方格內(nèi)，觀察大鼠在3 min內(nèi)穿越格數(shù)(3爪均進(jìn)入的方格方可記數(shù)，為水平運(yùn)動(dòng)得分)、后肢直立次數(shù)(兩前爪騰空或攀附墻壁，為垂直運(yùn)動(dòng)得分)。每只大鼠進(jìn)行1次測(cè)定，每次3 min。由2位觀察者打分，取均值。分別于第0、21、42天測(cè)定。曠場(chǎng)試驗(yàn)的水平運(yùn)動(dòng)減少反映動(dòng)物的活動(dòng)度降低；垂直運(yùn)動(dòng)減少反映動(dòng)物對(duì)新鮮環(huán)境的好奇程度降低，探索行為減少。

1.2.4 免疫組化 曠場(chǎng)試驗(yàn)結(jié)束后，所有大鼠10%水合氯醛(3 ml/kg)腹腔注射麻醉，暴露心臟，以生理鹽水(37℃)約250 ml經(jīng)升主動(dòng)脈灌注沖洗后，灌注4%多聚甲醛溶液(4℃,pH=7.4)200 ml，直至動(dòng)物四肢僵硬。斷頭取腦，腦組織置于10%福爾馬林溶液中固定24 h，參照大鼠腦立體定位圖譜[5]對(duì)大鼠海馬組織取材，常規(guī)脫水，浸蠟包埋，置于APES防脫玻片上(片厚4 μm)。60°烤片4 h，常規(guī)二甲苯脫蠟，梯度酒精脫水，0.01 mol/L PBS(pH=7.2~7.4)浸洗2 min，共3次；3%H2O210 min，PBS浸洗2 min，共3次；浸入0.01 mol/L檸檬酸鹽緩沖液(pH=6.0)。微波熱修復(fù)后，滴加一抗 Bcl-2(1∶150)、Bax(1∶300)，陰性對(duì)照組加0.01 mol/L PBS代替一抗，4℃冰箱孵育過(guò)夜，室溫復(fù)溫30 min后PBS浸洗5 min，共3次后滴加非生物素二抗，濕盒中室溫30 min，PBS浸洗5 min，共3次，DAB顯色光鏡下控制時(shí)間，常規(guī)脫水，透明，中性樹(shù)膠封片。光學(xué)顯微鏡下觀察，攝片。

1.2.5 圖像分析 采用Image Pro plus 5.1圖像分析系統(tǒng)測(cè)定每張照片的平均光密度值(AOD)，每張切片同一部位取5個(gè)不同的視野，所得數(shù)據(jù)以(±s)表示。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，所有計(jì)量數(shù)據(jù)以(±s)表示，進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)，多個(gè)樣本均數(shù)比較采用方差分析，組間多重比較采用SNK-q檢驗(yàn)法。顯著性水平α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 曠場(chǎng)試驗(yàn) 造模后，模型組水平運(yùn)動(dòng)得分、垂直運(yùn)動(dòng)得分均明顯低于對(duì)照組(P<0.01)，與其他組比較無(wú)顯著性差異(P>0.05)。給藥后，模型組水平運(yùn)動(dòng)得分、垂直運(yùn)動(dòng)得分明顯低于對(duì)照組(P<0.01)，高、中、低劑量組和鹽酸氟西汀組均明顯高于模型組(P<0.01)。見(jiàn)表1。

2.2 Bax和Bcl-2免疫組化 Bax蛋白陽(yáng)性表達(dá)為黃色或棕黃色染色，染色深淺不一，主要位于細(xì)胞質(zhì)中，胞核不染色。模型組表達(dá)明顯強(qiáng)于對(duì)照組(P<0.01)，高、中劑量組和鹽酸氟西汀組與模型組比較陽(yáng)性表達(dá)降低(P<0.05)。見(jiàn)表2。

Bcl-2蛋白陽(yáng)性表達(dá)為染色深淺不一的黃色或棕黃色染色，主要在細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)，胞核不染色。Bcl-2在模型組中陽(yáng)性表達(dá)最弱，而在對(duì)照組中表達(dá)最強(qiáng)，高、中劑量組和鹽酸氟西汀組表達(dá)均較模型組增強(qiáng)(P<0.05)。見(jiàn)表2。

表1 曠場(chǎng)行為學(xué)測(cè)定比較

表2 各組大鼠海馬組織中Bax和Bcl-2陽(yáng)性表達(dá)平均光密度值

3 討論

慢性輕度不可預(yù)見(jiàn)性的應(yīng)激抑郁模型主要模擬了人類抑郁的快感缺乏、運(yùn)動(dòng)能力及社會(huì)交往能力下降、探索行為能力下降、侵犯攻擊能力缺陷、性行為能力下降等癥狀，是國(guó)際上公認(rèn)的抑郁癥模型，文獻(xiàn)報(bào)道，慢性應(yīng)激引起的抑郁狀態(tài)及行為異?？杀３?jǐn)?shù)月[6]。

海馬是邊緣系統(tǒng)重要組成部分，參與情緒、學(xué)習(xí)和記憶、行為、免疫等的調(diào)節(jié)，它的損傷在各種應(yīng)激所致疾患中起到關(guān)鍵作用[7]。慢性應(yīng)激增加海馬神經(jīng)元細(xì)胞凋亡，引起海馬結(jié)構(gòu)和功能的變化，參與抑郁癥的發(fā)病[3]。

本研究結(jié)果顯示，造模成功后經(jīng)過(guò)氟西汀和舒郁寧心中藥干預(yù)，大鼠海馬區(qū)凋亡調(diào)控蛋白Bcl-2和Bax表達(dá)發(fā)生了變化，提示舒郁寧心湯可能是通過(guò)調(diào)節(jié)大鼠海馬區(qū)凋亡調(diào)控蛋白Bcl-2和Bax來(lái)對(duì)抗海馬神經(jīng)元細(xì)胞凋亡，從而發(fā)揮抗抑郁的作用。

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[7]董愛(ài)國(guó),趙麗麗,李海紅.BDNF在抑郁癥發(fā)病機(jī)制中的作用及其抗抑郁作用機(jī)制的研究進(jìn)展[J].中國(guó)醫(yī)療前沿,2011,6(6):16-18.