茯苓多糖抗氧化性研究

李燕凌，張志旭，胡 令

1湖南省蔬菜研究所，長沙410125;2國家中醫(yī)藥管理局亞健康干預(yù)技術(shù)實(shí)驗(yàn)室，長沙410128;3湖南信息科學(xué)職業(yè)技術(shù)學(xué)院，長沙410151

茯苓多糖抗氧化性研究

李燕凌1，張志旭2*，胡 令3

1湖南省蔬菜研究所，長沙410125;2國家中醫(yī)藥管理局亞健康干預(yù)技術(shù)實(shí)驗(yàn)室，長沙410128;3湖南信息科學(xué)職業(yè)技術(shù)學(xué)院，長沙410151

采用分光光度法研究了茯苓多糖提取物的體外抗氧化作用，并與VC進(jìn)行比較。結(jié)果表明其具有較強(qiáng)的抗氧化能力，在清除DPPH·的體系中和還原能力體系中，樣品的清除能力均超過VC，但在羥基自由基·OH和超氧陰離子O-·2體系中，其清除能力低于對照樣VC。

多糖;茯苓

茯苓為多孔菌科真菌茯苓(Poria cocos(Schw.) Wolf)的干燥菌核，為我國傳統(tǒng)中藥，是多種方劑及中成藥的原料，有“十藥九茯苓”之說。在我國主產(chǎn)地為湖南、湖北、安徽、河南、云南、貴州、四川等?。?］。氧化代謝是機(jī)體在生命活動(dòng)必不可少的一個(gè)的過程，然而在這個(gè)過程中往往不可避免的產(chǎn)生各種活性氧自由基，這些物質(zhì)很容易損傷組織，進(jìn)而引起各種疾病，因此對抗氧化損傷的藥物的研究日益受到人類的關(guān)注［2，3］。本文將對茯苓多糖的抗氧化能力進(jìn)行測定，旨在為茯苓多糖藥物及功能性食品開發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

無水乙醇、三氯甲烷、鄰二氮菲、硫酸亞鐵、過氧化氫、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀、鹽酸萘乙二胺、鄰苯三酚、三羥基氨基甲烷(Tris)等均為國產(chǎn)分析純，1， 1-二苯基-2-苦苯肼自由基(DPPH·)購于Sigma公司

1.2 主要儀器

紫外分光光度計(jì)，日立UV-3310

1.3 實(shí)驗(yàn)材料

茯苓原料由湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)食用菌研究所提供。對茯苓采用熱水提取法獲得水溶性粗多糖，然后用離子交換樹脂和大孔吸附樹脂對茯苓多糖溶液脫色，用sevag法除蛋白，最后得到茯苓多糖，經(jīng)檢測多糖含量為95.26%。根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求配制不同溶度的茯苓多糖溶液進(jìn)行抗氧化實(shí)驗(yàn)。

1.4 抗氧化測定

1.4.1 試劑的配制

1.4.1.1 pH 7.4的磷酸鹽緩沖液的配制:將無水磷酸氫二鈉和磷酸二氫鉀在115±5℃干燥2～3 h，分別稱取8.606 g與2.358 g，加水使其充分溶解后，并稀釋，定容至2000 mL。

1.4.1.2 50 mmol/L，pH8.2 Tris-HC1緩沖溶液的配制:取25 mL 0.l mol/L Tris與15 mL 0.1 mol/L HC1混勻，加水定容到50 mL，即可得到pH 8.2的緩沖溶液，用酸度計(jì)測其pH值。若該緩沖溶液的pH值誤差不在0.02范圍之內(nèi)就必須重新調(diào) pH值。

1.4.1.3 8 mol/L的HCl溶液的配制:取144 mL分析純的HCl用蒸餾水定容至200 mL。

1.4.2 清除羥基自由基(·OH)能力的測定［3］

首先取濃度為2.5 mmo1/L的鄰二氮菲溶液3 mL，然后取2.0 mL pH 7.4的磷酸鹽緩沖液，將兩者充分混勻，加入15 mmo1/L的FeSO4溶液0.5 mL后，立即混勻，再加入l.0 mL/L的H2O21.0 mL，最后使用蒸餾水將剩余體積補(bǔ)充至10.0 mL，在溫度為37℃條件下保溫，1 h后取出，在510 nm處測定吸光度(此為損傷管吸光度);之后分別加入濃度不同的試樣溶液1 mL，再加l.0 mL/L的H2O21.0 mL，未損傷管不需要加提取物和H2O2。按下式計(jì)算清除率:

式中:A0—未損傷管的吸光度

A1—損傷管的吸光度

A2—加提取物的吸光度

取4.5 mL Tris-HCI緩沖溶液，于20℃水浴中進(jìn)行預(yù)熱，20 min后，分別加入1 mL不同濃度的試樣溶液和0.4 mL濃度為25 mmo1/L的鄰苯三酚溶液，充分混勻后，于25℃水浴中反應(yīng)5 min，然后加入1 mL濃度為8 mo1/L的HC1溶液終止反應(yīng)，最后在299 nm處測定吸光度A1，空白則以蒸餾水代替樣品液，測定吸光度A0。按下式計(jì)算清除率:

1.4.4 清除DPPH·能力的測定［5］

分別取2 mL濃度不同的樣品液放置于試管中，加入2 mL 2×10-4mol/L的DPPH溶液，混合均勻，反應(yīng)30 min，在513 nm處測定其吸光度，同時(shí)測定樣品空白的吸光度，以及不加樣品液的空白樣的吸光度。按下式計(jì)算其對DPPH抑制率:

式中:A1=2 mL DPPH·溶液+2 mL樣品液的吸光度;

A2=2 mL樣品液+2 mL無水乙醇的吸光度;

A0=2 mL DPPH·溶液+2 mL無水乙醇的吸光度。

1.4.5 還原能力的測定［8］

分別取不同濃度的樣品液2.5 mL加入到體積為2.5 mL的pH=6.6的磷酸鹽緩沖液中，然后加1%的鐵氰化鉀溶液2.5 mL，混勻后在50℃條件下恒溫，20 min后，再加入2.5 mL濃度為10%的三氯乙酸溶液，然后以3000 rpm離心分離l0 min，取上層清夜5 mL加蒸餾水5 mL和0.1%FeCl3溶液1 mL，在700 nm處測定吸光度，吸光度越高，還原能力越強(qiáng)。

2 結(jié)果與分析

2.1 茯苓多糖提取物對·OH的清除作用

如圖1所示，試驗(yàn)用Fenton法考察茯苓多糖和Vc對·OH清除效果，與對照組比較P＜0.01。樣品的清除率在試驗(yàn)濃度范圍內(nèi)與樣品濃度呈正相關(guān)，但低于對照樣VC，當(dāng)樣品濃度為8 mg/mL時(shí)，清除率達(dá)到了76.7%。

圖1 不同濃度的茯苓多糖對·OH的清除作用Fig.1 Scavenging effect on·OH by different concentration of polysaccharides from P.cocos

如圖2所示，樣品在試驗(yàn)濃度范圍內(nèi)，清除率與樣品濃度呈正相關(guān)，與對照組比較P＜0.01。清除率低于對照品Vc，而且一直低于60%。在10 mg/ mL時(shí)基本達(dá)到最大值為59.3%。

圖2 不同濃度的茯苓多糖對O的清除作用Fig.2 Scavenging effect on Oby different concentration of polysaccharides from P.cocos

2.3 茯苓多糖提取物對DPPH·的清除作用

如圖3所示，清除率在一定的實(shí)驗(yàn)濃度范圍內(nèi)與樣品濃度呈正相關(guān)，與對照組比較P＜0.01。當(dāng)樣品濃度大于0.5 mg/mL時(shí)，其清除率大于 Vc。Vc在濃度在為0.5～3 mg/mL時(shí)，隨著濃度增加DPPH清除率增加較快，之后則趨于穩(wěn)定，即使這樣其清除能力仍然一直低于樣品，樣品濃度為5 mg/ mL時(shí)，樣品清除率基本到達(dá)最大值，為93.4%。

圖3 不同濃度的茯苓多糖對DPPH·的清除作用Fig.3 Scavenging effect on DPPH·by different concentration of polysaccharides from P.cocos

2.4 茯苓多糖提取物還原能力的測定

如圖4所示，樣品的還原能力在試驗(yàn)濃度范圍內(nèi)與樣品濃度呈正相關(guān)，與對照組比較P＜0.01。在濃度大于2 mg/mL后，樣品還原力大于Vc。Vc濃度在0.5～3 mg/mL時(shí)還原能力增加較快，之后則趨于穩(wěn)定。但其清除能力一直低于樣品。當(dāng)樣品濃度為5 mg/mL時(shí)，達(dá)到最大的還原力為0.942。

圖4 不同濃度的茯苓多糖還原力測定Fig.4 Assay of reducing ability by different concentration of polysaccharides from P.cocos

3 結(jié)論

通過對四種不同的體系自由基清除率的測定，研究了茯苓多糖提取物的抗氧化性能。結(jié)果表明，其具有較強(qiáng)的抗氧化能力和抗氧化的多樣性，在·OH和O-·2體系中，雖然其清除能力低于對照樣VC，但也顯示出較強(qiáng)的自由基清除能力，作用機(jī)理可能是多糖分子上具有還原性的半縮醛羥基，與活性氧自由基發(fā)生氧化還原作用，·OH可快速地獲取多糖碳?xì)滏溕系臍湓咏Y(jié)合成水，多糖的碳原子上則留下一個(gè)成單電子，成為碳自由基，進(jìn)一步氧化形成過氧化自由基，最后分解成對機(jī)體無害的產(chǎn)物，可將激發(fā)能傳遞給多糖，使多糖處于激發(fā)態(tài)而本身回到基態(tài)［10］。在清除DPPH·的體系中和還原能力體系中，樣品的清除能力均超過VC，這兩個(gè)體系中，自由基的基礎(chǔ)基團(tuán)為有機(jī)大分子，茯苓多糖分子容易捕獲自由基并與其結(jié)合，因此顯示出較強(qiáng)的自由基清除能力。隨著濃度的升高，多糖溶液達(dá)到飽和，多糖分子之間互相產(chǎn)生排斥，對于自由基的捕獲能力下降，清除能力達(dá)到飽和。茯苓在中國已經(jīng)得到了廣泛的栽培，本文通過體外試驗(yàn)方面證明了茯苓多糖提取物具有很強(qiáng)抗氧化性能，為茯苓多糖提取物進(jìn)一步開發(fā)成特異性的抗氧化功能產(chǎn)品提供了理論依據(jù)。

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Antioxidation of Polysaccharides from Poria cocos

LI Yan-ling1，ZHANG Zhi-xu2*，HU Ning31Hunan Vegetable Institute，Changsha 410125，China;2State Key Laboratory of Subhealth Intervene Technology，Changsha 410128，China;3Hunan Information-science Technology College，Changsha 410151，China

The research compared antioxidation in vitro of polysaccharides from Poria cocos with Vc by using spectrophotometry.The results showed that polysaccharides from P.cocos had powerful ability of antioxidation.In the system of DPPH·and reducing system，the sample was superior to Vc in scavenging ability.But it was inferior to Vc in the system of hydroxyl radical and superoxide anion.

polysaccharides;Poria cocos

1001-6880(2012)08-1126-03

2011-08-01 接受日期:2011-11-02

*通訊作者 Tel:86-018684688522;E-mail:youknowme@tom.com

R284.2;R285.5

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