紅托竹蓀多糖抗氧化活性的研究

王蓓蓓，段玉峰，邵紅軍，田 甜，牛付閣，梁 蕾

陜西師范大學(xué)食品工程與營(yíng)養(yǎng)科學(xué)學(xué)院，西安710062

紅托竹蓀(Dictyophora rubrovalvata)是1976年發(fā)表的新種，是由我國(guó)學(xué)者命名的。它是一種擔(dān)子菌(Eumycota)、擔(dān)子菌亞門(Basidiomycotina)、腹菌綱(Gasteromycetes)、鬼筆目(Phallales)、鬼筆科(Phallaceae)、竹蓀屬(Dictyophora)，野生紅托竹蓀主要分布于中國(guó)貴州中(西)部、云南、四川和浙江等省區(qū)竹林下的腐殖土上。紅托竹蓀較高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，此外還含有極為豐富的礦物元素［1，2］。除其營(yíng)養(yǎng)價(jià)值外，同時(shí)還具有一定的防病保健作用，長(zhǎng)期服用竹蓀具有治療慢性氣管炎、降低血壓和減少血液中的膽固醇含量等功能。紅托竹蓀是竹蓀中的珍品，具有很大的開(kāi)發(fā)優(yōu)勢(shì)。多糖是紅托竹蓀子實(shí)體中重要組成成分之一。關(guān)于竹蓀生物活性成分的研究最早見(jiàn)于日本人對(duì)長(zhǎng)裙竹蓀多糖抗腫瘤的研究，表明其具有抗腫瘤，提高免疫力的功能［3］。目前，對(duì)紅托竹蓀的研究主要集中于栽培條件［4］、多糖的提取工藝及其抗腫瘤［3］的研究。國(guó)內(nèi)外對(duì)紅托竹蓀多糖的體外抗氧化活性研究較少［3，5］。

鑒于此，本論文主要以貴州織金縣紅托竹蓀為研究對(duì)象，對(duì)其中多糖的抗氧化活性進(jìn)行研究，從而為進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用紅托竹蓀提供一定的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

紅托竹蓀購(gòu)于貴州織金縣，由中國(guó)科學(xué)院昆明植物研究所副研究員于富強(qiáng)鑒定為紅托竹蓀(D.rubrovalvata)乙醇(75%)、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、鄰苯三酚、FeSO4·7H2O、DPPH自由基、H2O2、抗壞血酸(VC)、二丁基羥基甲苯(BHT，食品級(jí)); RE-52AA型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠); SHZ-III型循環(huán)真空泵(上海亞榮生化儀器廠); AL204電子天平(梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司);HHW-21CU-600型電熱恒溫水槽(上海?，攲?shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司);DGX-9073B-1電熱鼓風(fēng)干燥箱(上海福瑪實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司);Alphal-4型真空冷凍干燥機(jī)(德國(guó)Chris公司);WFJ2000型可見(jiàn)分光光度計(jì)(尤尼柯(上海)儀器有限公司);T6新世紀(jì)紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)(北京普析通用儀器有限責(zé)任公司);800B型離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠)

2 方法

2.1 紅托竹蓀多糖粗提物的制備

稱取烘干的紅托竹蓀15 g，過(guò)40目篩，用75%乙醇脫脂48 h，揮干乙醇，然后以水為提取溶劑，料液比1∶31，提取溫度75℃，提取3.5 h，對(duì)提取液進(jìn)行離心(3000 rpm)20 min，取上清液。將得到的粗提液減壓濃縮至膏狀，用少量蒸餾水溶解所得到的濃縮物，直至無(wú)色。然后將得到的濃縮物真空冷凍干燥24 h，得到竹蓀多糖粗提物，備用。

總糖含量測(cè)定采用苯酚-硫酸法［6］。繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線:準(zhǔn)確稱取標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖20 mg于500 mL容量瓶中，蒸餾水定容。精確稱取0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9和1.0 mL，分別加入試管中，補(bǔ)水至2.0 mL，加入6%苯酚1.0 mL和濃硫酸5 mL，放置10 min后，搖勻，室溫放置20 min，于490 nm處測(cè)定吸光度值，平均測(cè)定三次，取平均值，以2.0 mL蒸餾水同樣操作作為空白，以葡萄糖濃度作為橫坐標(biāo)，吸光度值作為縱坐標(biāo)，得葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程。

樣品的測(cè)定，取一定濃度的樣品溶液1.0 mL，補(bǔ)水至2.0 mL，其他操作同上，測(cè)定吸光度值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算多糖含量。

2.3 紅托竹蓀多糖總還原能力的測(cè)定

一般情況下，樣品的還原能力與抗氧化活性之間有顯著的相關(guān)性。樣品反應(yīng)后的生成物在700 nm處的吸光度的大小即反映了其抗氧化能力的大小，吸光度值越大，則樣品的還原能力越強(qiáng)，紅托竹蓀多糖的還原力測(cè)定依照文獻(xiàn)進(jìn)行［7］。于1 mL不同濃度的紅托竹蓀多糖溶液中加入2.5 mL，0.2 mol/L，pH為6.6的磷酸鹽緩沖液和2.5 mL，1%的鐵氰化鉀溶液，50℃水浴20 min，加入2.5 mL，10%的三氯乙酸(TCA)溶液，3000 rpm離心10 min，取2.5 mL的上清液，加入2.5 mL蒸餾水0.5 mL FeCl3(0.1%)，于700 nm處測(cè)定吸光值。以VC和BHT為對(duì)照，每組做3個(gè)重復(fù)，求其平均值。

2.4 紅托竹蓀多糖對(duì)超氧陰離子自由基的清除作用

采用鄰苯三酚自氧化法［8］，取pH為8.12的Tris-HCl緩沖液6.0 mL和蒸餾水0.5 mL，混勻，37℃水浴10 min，加入37℃預(yù)熱過(guò)的7 mmol/L鄰苯三酚鹽酸溶液(PR)1 mL，迅速搖勻，混勻后精確反應(yīng)4 min，用0.5 mL濃鹽酸終止反應(yīng)，測(cè)325 nm處吸光度值A(chǔ)0。取pH為8.12的Tris-HCl緩沖液6 mL，分別加入不同質(zhì)量濃度的竹蓀多糖溶液0.5 mL，37℃水浴10 min，最后加入37℃預(yù)熱過(guò)的7 mmol/L鄰苯三酚鹽酸溶液(PR)1 mL，迅速搖勻，混勻后精確反應(yīng)4 min，用0.5 mL濃鹽酸終止反應(yīng)，測(cè)325 nm處吸光度值A(chǔ)。以VC和BHT作為陽(yáng)性對(duì)照，每組做3個(gè)重復(fù)，求其平均值。

計(jì)算公式如下:

2013年，水利系統(tǒng)迎難而上，在成功應(yīng)對(duì)東北流域性大水、南方大范圍干旱、沿海超強(qiáng)臺(tái)風(fēng)等方面做了大量工作，水利事業(yè)取得新進(jìn)展，有力支撐了糧食“十連增”和經(jīng)濟(jì)社會(huì)發(fā)展。謹(jǐn)向全國(guó)廣大水利干部職工表示誠(chéng)摯問(wèn)候！希望同志們認(rèn)真落實(shí)黨中央、國(guó)務(wù)院決策部署，圍繞改革創(chuàng)新、轉(zhuǎn)型升級(jí)和民生改善，集中力量建設(shè)一批重大關(guān)鍵性水利工程，夯實(shí)農(nóng)田水利基礎(chǔ)，增強(qiáng)防災(zāi)抗災(zāi)能力，嚴(yán)格水資源管理，為全面建成小康社會(huì)提供堅(jiān)實(shí)的水安全保障。

2.5 紅托竹蓀多糖對(duì)羥基自由基的清除作用［9，10］

利用Smironff等的改進(jìn)方法，在10 mL的試管中依次加6 mmol/L FeSO42 mL、2 mL不同濃度的竹蓀多糖溶液或VC溶液、BHT溶液，以及6 mmol/L的 H2O2溶液2 mL，搖勻，靜置 10 min，再加入6 mmol/L的水楊酸溶液2 mL，搖勻，靜置30 min后，于510 nm處測(cè)定吸光值，以VC和BHT作為陽(yáng)性對(duì)照，每組做3個(gè)重復(fù)，求其平均值。按以下公式計(jì)算各試樣對(duì)羥基自由基(OH·)的清除率:

清除率(%)=A0-(AS-AX)/A0×100%

式中:A0—不加樣品溶液的吸光值;AS—加入樣品溶液反應(yīng)后的吸光值;AX—不加水楊酸溶液時(shí)紅托竹蓀多糖的吸光值;

2.6 紅托竹蓀多糖對(duì)DPPH自由基的清除作用［7］

將紅托竹蓀多糖、VC和BHT分別配成等濃度(0.2～1.2 mg/mL)的溶液，吸取0.5 mL試樣與0.5 mL水于試管中，混合均勻后，再加入DPPH·溶液充分搖勻，在室溫下避光保存20 min，然后在517 nm處測(cè)定吸光值，并以VC和BHT作陽(yáng)性對(duì)照，以95%乙醇調(diào)零，每個(gè)處理試樣均做三個(gè)平行實(shí)驗(yàn)，按下式計(jì)算各試樣對(duì)DPPH·自由基的清除率:

式中:A0—0.5 mL95%乙醇+0.5 mL水+2 mL DPPH·的吸光值;AS—0.5 mL試樣+0.5 mL水+2 mL DPPH·的吸光值;AX—0.5 mL試樣+ 0.5 mL水+2 mL95%乙醇的吸光值;

2.7 半數(shù)清除率(EC50)的測(cè)定

EC50指清除率為50%時(shí)所需樣品的質(zhì)量濃度。所需質(zhì)量濃度越低，表明半清除率越高，清除效果越好［11］。將各項(xiàng)實(shí)測(cè)數(shù)據(jù)用擬合優(yōu)化法來(lái)模擬S曲線，可通過(guò)Scatchard法和Hill法使量效關(guān)系S型曲線直線化［12］，并得出線性方程y=mx+c，從中即可計(jì)算出EC50值。

3 結(jié)果與分析

3.1 總糖含量

所測(cè)得結(jié)果做標(biāo)準(zhǔn)曲線:y=0.1061x+0.1566(R2=0.9902)，以葡萄糖濃度作為橫坐標(biāo)，吸光度值作為縱坐標(biāo)。計(jì)算出提取物中總糖含量為80.9%.

3.2 總還原能力的測(cè)定

圖1 紅托竹蓀多糖總還原能力的測(cè)定Fig.1 Reducing capacity of polysaccharides from D.rubrovalvata

由圖4所示，紅托竹蓀多糖具有一定的還原能力，隨著多糖質(zhì)量濃度的增大，總還原能力隨之增強(qiáng)。在所測(cè)定的濃度范圍內(nèi)，紅托竹蓀多糖的還原能力稍低于BHT的，但明顯低于VC的。

3.3 對(duì)超氧陰離子自由基的清除作用

圖2 紅托竹蓀多糖對(duì)超氧陰離子自由基的清除作用Fig.2 Scavenging activities on O of polysaccharides from D.rubrovalvata

由圖1所示，在樣品濃度低于0.4 mg/mL時(shí)，紅托竹蓀多糖對(duì)超氧陰離子自由基的清除作用很小，但隨著質(zhì)量濃度的增大，清除率逐漸增大，最大可達(dá)到20%。當(dāng)質(zhì)量濃度大于0.6 mg/mL時(shí)，多糖的清除效果大于BHT的，但都小于VC的。

3.4 對(duì)羥基自由基的清除作用

由圖2所示，紅托竹蓀多糖對(duì)OH·的有一定的清除作用，其清除率最大可達(dá)到59%，在所測(cè)定的濃度范圍內(nèi)，紅托竹蓀多糖對(duì)OH·的清除效果明顯大于BHT的46.7%，但都明顯小于VC的。

圖3 紅托竹蓀多糖對(duì)羥基自由基的清除作用Fig.3 Scavenging activities on OH· of polysaccharides from D.rubrovalvata

3.5 對(duì)DPPH自由基的清除作用［13］

圖4 紅托竹蓀多糖對(duì)DPPH自由基的清除作用Fig.4 Scavenging activities on DPPH· of polysaccharides from D.rubrovalvata

由圖3所示，在實(shí)驗(yàn)所測(cè)的濃度范圍內(nèi)，紅托竹蓀多糖對(duì)DPPH自由基有一定的清除效果，并隨著樣品質(zhì)量濃度的增大，清除率逐漸增大，呈現(xiàn)一定的量效關(guān)系。并且紅托竹蓀多糖對(duì)DPPH自由基的清除效果大于BHT的，但小于VC的。

3.6 半數(shù)清除質(zhì)量濃度(EC50)測(cè)定結(jié)果［14］

表1 多糖、BHT和VC的EC50值Table 1 The value of EC50on polysaccharides，BHT and VC

EC50值越低，表明清除率越高，清除效果越好。由表1可知，紅托竹蓀多糖清除O和DPPH·的EC50值明顯小于BHT的，表明紅托竹蓀多糖有一定的抗氧化能力。

4 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)采用體外產(chǎn)生的活性自由基系統(tǒng)，通過(guò)測(cè)定樣品中總多糖對(duì)自由基的清除作用，從而對(duì)紅托竹蓀的抗氧化能力進(jìn)行研究。在所測(cè)定的濃度范圍內(nèi)，紅托竹蓀多糖對(duì)O-·2、OH·均有一定的清除作用，其清除效果與BHT的基本相當(dāng)，但都明顯低于VC的清除能力;對(duì)DPPH自由基有一定的清除作用，且略高于BHT的清除作用，但都低于VC。總體而言，紅托竹蓀多糖具有一定的抗氧化能力，為進(jìn)一步的開(kāi)發(fā)利用提供了理論依據(jù)。

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