新疆野生黨參總黃酮體內(nèi)抗氧化及抗疲勞作用研究

汪建紅，原 慧，李雪紅

1新疆師范大學生命科學學院，烏魯木齊830054;2新疆獸藥飼料監(jiān)察所，烏魯木齊830063

黨參為桔?？浦参稂h參屬黨參Codonopsis pilosula(Franch.)Nannf.多年生草本。其抗寒性、抗旱性、適生性都很強。中國東北、華北、西北各地都有分布。傳統(tǒng)醫(yī)學認為，黨參具有補中益氣、生津止渴、活血化瘀、調(diào)理脾胃、健脾益肺等作用，因而，黨參除了藥用以外，已成為廣大民眾日常食用、飲用的補品。現(xiàn)代藥理研究發(fā)現(xiàn)，黨參可以增強體質，提高人體免疫力，具有抗衰老、抗氧化、抗缺氧、抗疲勞、抗腫瘤、增強記憶和提高學習能力等功能;現(xiàn)代藥學試驗證明，黨參含有多糖、皂甙、生物堿、黃酮、揮發(fā)油等多種天然藥理活性成分［1-5］。黃酮是其主要藥效成分之一［6］。新疆野生黨參Codonopsis clematidea (Schrenk)Clarke.生于海拔1500～2500 m的山坡及云杉林下［7］。南北疆均有分布，資源豐富。然而，有關新疆野生黨參的研究報道很少見。尤其是對新疆野生黨參黃酮體內(nèi)抗氧化抗疲勞的研究還未見報道。研究發(fā)現(xiàn)運動疲勞的產(chǎn)生與運動時產(chǎn)生的自由基對機體的損害、能源物質的耗竭及代謝產(chǎn)物的堆積有關，故本實驗選擇了超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、肝糖原、肌糖原、血清尿素氮等指標進行檢測，用于探討新疆野生黨參黃酮類化合物的抗氧化抗疲勞生理功效，旨在為合理開發(fā)利用新疆野生黨參植物資源提供實驗依據(jù)。

1 實驗材料

1.1 主要儀器

FC204電子分析天平(上海天普分析儀器有限公司);722N可見分光光度計(上海精密科學儀器有限公司);TDL-60B型低速臺式離心機(上海安亭科學儀器廠);HWS2B型電熱恒溫水浴鍋(上海一恒科技有限公司);RE-52旋轉蒸發(fā)器(上海青浦瀘西儀器廠);聚酰胺(30～60目，150～200目);聚酰胺薄膜(浙江臺州四清化工廠生產(chǎn));Sephadex LH-20(Pharmmacia公司產(chǎn)品，進口分裝);SHB-Ⅲ循環(huán)水式多用真空泵(鄭州長城科工貿(mào)有限公司)。

1.2 實驗試劑

超氧化物歧化酶(SOD)測定試劑盒、丙二醛(MDA)測定試劑盒、血清尿素氮測定試劑盒、考馬斯亮蘭蛋白測定試劑盒(南京建成生物工程研究所);甲醇、乙醇、乙酸乙酯等均為RA級(天津試劑公司生產(chǎn))

1.3 實驗樣品與動物

實驗樣品:新疆野生黨參采自烏魯木齊市南山水西溝，自然風干，總黃酮由本實驗室提取，提取方法見李云志，曾凡駿黃酮提取法［8］(提取工藝流程:秤取一定量自然風干研碎的新疆野生黨參粉末，用95%的乙醇回流加熱提取，提取液用石油醚萃取，直至醚層無色，然后用乙酸乙酯多次萃取，直至酯層無色，合并提取液并減壓濃縮至膏狀，將萃取物用水溶解，抽濾，上聚酰胺柱(30～60目)，先用去離子水洗脫，再用甲醇梯度洗脫，分部收集，TLC檢測，歸并。薄層溶劑系統(tǒng):甲醇∶氯仿∶丁酮=3∶7∶0.5，30～50%的甲醇部分上聚乙酰柱(150～200目)，收集50%部分，蒸餾水溶解，上Sephadex LH-20柱，乙醇梯度洗脫，純化得黃色粉末。含量測定:經(jīng)分光光度法，以蘆丁為標準品繪出標準曲線，在510 nm處測定吸光度值，由回歸方程計算出黃酮含量為39.64%)。樣品用蒸餾水溶解，稀釋至所需濃度，置冰箱4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

實驗動物:昆明種小白鼠，雄性，體重18～22 g，購于新疆醫(yī)科大學實驗動物中心。

2 實驗方法

取體重18～22 g的健康昆明種雄性小鼠160只，在實驗條件下適應喂養(yǎng)5 d后開始實驗:隨機將小鼠分為4組，空白對照組、低劑量組、中劑量組與高劑量組。給每只小鼠標號分組，稱體重，換算灌胃劑量，以后每天定時給小鼠灌胃，觀察小鼠狀況，并且每三天稱體重確定繼續(xù)灌胃量。低劑量組、中劑量組、高劑量組每天分別一次性灌胃0.25、0.5、1 mg/kg體重新疆野生黨參黃酮溶液，空白對照組灌胃生理鹽水。連續(xù)灌胃25 d，灌胃期間自由取水和飲食。

2.1 小鼠血清、肝臟SOD、MDA值測定

灌胃處理25 d后，每組隨機選取10只小鼠，于末次灌胃30 min后，摘眼球取血，分離血清用于測定血清SOD、MDA值;頸椎脫臼處死小鼠，迅速解剖取出肝臟制備肝組織勻漿用于測定肝臟SOD、MDA值。

2.1.1 超氧化物歧化酶(SOD)的測定

采用黃嘌呤氧化酶法測定并計算出被測樣品的SOD活力。

2.1.2 丙二醛(MDA)

采用硫代巴比妥酸法(Thibabituric acid，TBA)測定并計算出被測樣品的MDA含量。

2.1.3 蛋白質含量測定

采用考馬斯亮蘭顯色法測定并計算出肝組織蛋白質含量。

2.2 負重游泳實驗

連續(xù)灌胃25 d后，每組各選取10只小鼠，于末次灌胃30 min后，尾跟部負荷5%體重的鉛皮，置小鼠于水深30 cm，直徑15 cm，水溫27～30℃的玻璃缸中，記錄小鼠自入水開始到頭部全部沒入水中8 s不能浮出水面為止的時間，作為小鼠游泳的時間。

2.3 小鼠肝糖原、肌糖原的測定

灌胃處理25 d后，每組隨機選取10只小鼠，于末次灌胃30 min后，頸椎脫臼處死小鼠，迅速取出小鼠肝臟和后腿肌肉，生理鹽水漂洗，濾紙吸干，精確稱取0.5 g，提取糖原進行肝糖原與肌糖原的測定。采用蒽酮硫酸比色法分別測定并計算出被測樣品的肝糖原、肌糖原含量。

2.4 小鼠血清尿素氮(BUN)測定

連續(xù)灌胃25 d后，每組各選取10只小鼠，于末次灌胃30 min后，置小鼠于水深30 cm，直徑15 cm，水溫27～30℃的玻璃缸中游泳30 min，摘眼球采血，分離血清用于血清尿素氮的測定。采用Fearon反應比色法測定并計算出被測樣品的尿素氮(BUN)含量。

2.5 統(tǒng)計學處理

3 結果

3.1 新疆野生黨參黃酮類化合物對小鼠SOD活力的影響

表1 新疆野生黨參黃酮類化合物對小鼠SOD活力的影響(n=10)Table 1 Effect of C.clematidea flavonoid on SOD activities of mice(n=10)

由表1數(shù)據(jù)可知，與對照組比較，低劑量組、中劑量組、高劑量組的血清 SOD活力分別升高8.90%、91.70%、186.91%，其中中劑量組和高劑量組有極顯著差異(P＜0.01);與對照組比較，低劑量組、中劑量組、高劑量組的肝勻漿SOD活力分別升高5.40%、102.10%、137.11%，其中中劑量組和高劑量組均有極顯著差異(P＜0.01)。低劑量組血清SOD活力與肝勻漿SOD活力與對照組比較有所升高，但均無顯著性差異(P＞0.05)。

3.2 新疆野生黨參黃酮類化合物對小鼠MDA值的影響

表2 新疆野生黨參黃酮類化合物對小鼠MDA值的影響(n=10)Table 2 Effect of C.clematidea flavonoid on MDA content of mice(n=10)

由表2數(shù)據(jù)可知，與對照組比較，低劑量組、中劑量組、高劑量組血清MDA值分別降低25.95%、53.22%、55.65%，高劑量組、中劑量組均有極著差異(P＜0.01)，低劑量組有顯著差異(P＜0.05);低劑量組、中劑量組、高劑量組肝組織勻漿MDA值分別降低7.97%、14.37%、25.25%，高劑量組和中劑量組有顯著差異(P＜0.05)，低劑量組肝勻漿MDA含量與對照組比較有所降低，但無顯著性差異(P＞0.05)。

3.3 新疆野生黨參黃酮類化合物對負重小鼠游泳時間的影響

表3 新疆野生黨參黃酮類化合物對小鼠負重游泳時間的影響(n=10)Table 3 Effect of C.clematidea flavonoid on swimming time of loaded mice(n=10)

由表3數(shù)據(jù)可知，低劑量組、中劑量組、高劑量 組比對照組小鼠游泳時間分別增加了15.71%、 53.20% 、71.29%，其中，中劑量組、高劑量組游泳時間與對照組比較有極顯著差異(P＜0.01)，表明能極顯著延長小鼠游泳時間，低劑量組與對照組比較游泳時間有所升高，但無顯著差異(P＞0.05)。

3.4 新疆野生黨參黃酮類化合物對小鼠肝糖原、肌糖原的影響

表4 新疆野生黨參黃酮類化合物對小鼠肝糖原、肌糖原的影響(n=10)Table 4 Effect of C.clematidea flavonoid on liver glycogen and muscle glycogen of mice(n=10)

由表4數(shù)據(jù)可知，低劑量組、中劑量組、高劑量組的肝糖原含量比對照組分別升高 11.43%、52.86%和105.71% ，其中高劑量組有極顯著差異(P＜0.01)、中劑量組有顯著差異(P＜0.05)、低劑量組雖有所上升，但無顯著差異(P＞0.05);與對照組比較，低劑量組、中劑量組、高劑量組的肌糖原含量分別升高56.52%、143.48%和147.83%，低劑量組、中劑量組、高劑量組均有極顯著差異(P＜0.01)。

3.5 新疆野生黨參黃酮類化合物對小鼠血清尿素氮的影響

表5 新疆野生黨參黃酮類化合物對小鼠血清尿素氮的影響(n=10)Table 5 Effect of C.clematidea flavonoid on blood urea nitrogen of mice(n=10)

從表5得知，低劑量組、中劑量組、高劑量組與對照組相比較，運動后小鼠低劑量組、中劑量組、高劑量組的血清尿素氮含量分別降低 3.28%、17.33%和23.38%，其中高劑量組、中劑量組均有極顯著差異(P＜0.01)，低劑量組雖有所下降，但無顯著差異(P＞0.05)。

4 討論

近些年來，隨著對自由基研究的不斷深入，衰老的自由基學說，運動疲勞運動損傷的自由基學說相繼被提出。藥用植物的有效成分如多糖、皂甙、黃酮等，作為天然抗氧化劑備受廣大學者的關注。黃酮類化合物的抗氧化作用是指其對單線態(tài)氧(1O2)和含氧自由基的清除能力。生物體內(nèi)含氧自由基包括超氧陰離子自由基(O-·2)、羥基自由基(·OH)和脂質過氧化自由基(ROO·)［9］。此類自由基可與體內(nèi)大量生命所必需的分子(如核酸、蛋白質)相互作用，從而對后者產(chǎn)生毒害作用［10］。類黃酮作為非常強的自由基消除劑以及單線態(tài)氧消除劑，可抑制脂質的過氧化作用。而且，類黃酮與過氧化自由基相反應，還終止了自由基的鏈式反應。Bombardelli和Morazzoni［11］觀察到，當一種多不飽和脂肪酸產(chǎn)生自動氧化時，類黃酮主要通過以下幾點顯出它們的抗氧化作用:(1)抗自由基活性(·OH，羥基;O2-·，超氧化物);(2)抗脂質氧化活性(R·，烷基;ROO·，過氧基;RO·，烷氧基);(3)抗氧活性(O2-·;1O2); (4)金屬鰲合活性。

SOD是機體清除氧自由基的重要酶，直接反映機體抗氧化水平。MDA是自由基引起的脂質過氧化的主要產(chǎn)物之一，MDA含量可間接表現(xiàn)機體抗氧化能力及清除氧化產(chǎn)物的能力。負重游泳實驗是評價抗運動性疲勞的重要指標。近來有學者提出運動引起的脂質過氧化反應加強而產(chǎn)生較多的自由基，會導致肌纖維膜及線粒體膜等生物膜完整性喪失及損傷，從而引發(fā)一系列細胞代謝機能紊亂，細胞廣泛性損害及病理變化，使肌肉工作能力下降產(chǎn)生疲勞。研究發(fā)現(xiàn)用藥物抑制動物體內(nèi)的SOD活性后，大鼠肌肉最大強直張力減少28%～52%，而給動物注射幾種自由基清除劑后可明顯降低自由基反應，顯著延長大鼠游泳時間［12］。本試驗研究表明短期灌胃新疆野生黨參黃酮類化合物三個濃度劑量組均可以延長負重小鼠的游泳時間，提高小白鼠的運動能力，而且，在一定范圍內(nèi)，隨濃度增加游泳時間增加明顯。以中劑量組(0.5 mg/kg/d)和高劑量組(1 mg/ kg/d)效果最佳(P＜0.01)(見表3)。本試驗研究3.1數(shù)據(jù)表明，短期灌胃新疆野生黨參黃酮類化合物后，中、高劑量給藥組的血清SOD活力明顯高于對照組(P＜0.01);高、中劑量給藥組小鼠肝臟的SOD活力與對照組相比有極顯著升高(P＜0.01) (見表1);與對照組相比，高、中劑量給藥組小鼠的血清MDA值有極顯著降低(P＜0.01)，低劑量給藥組小鼠的血清MDA值有顯著降低(P＜0.05);高、中劑量給藥組小鼠肝臟中的MDA值與對照組相比有明顯降低(P＜0.05)(見表2)。該結果表明新疆野生黨參黃酮類化合物能提高SOD活力，減少自由基的堆積，有助于體內(nèi)脂質過氧化物的清除，從而延緩疲勞出現(xiàn)，推測這是服藥組小鼠游泳耐力顯著提高的重要機制之一。

糖原是運動中最重要的能源物質，機體劇烈運動后大量糖原被消耗，因此糖原儲備可作為評價機體抗疲勞的另一重要指標。本研究分別測試了新疆野生黨參黃酮類化合物三個濃度劑量組對小鼠肝糖原、肌糖原的影響，并與對照組比較。結果顯示，中、高劑量給藥組的肝糖原含量有顯著升高(中劑量組:P＜0.05，高劑量組:P＜0.01)，低劑量組、中劑量組、高劑量組給藥組小鼠的肌糖原含量均有極顯著升高(P＜0.01)(見表4)。該結果提示，新疆野生黨參黃酮類化合物對維持肝糖原、肌糖原含量的水平有積極作用，從而延緩疲勞的出現(xiàn)。研究表明機體血尿素含量隨勞動及運動負荷的增加而增加，機體對負荷的適應能力越差，血尿素的增加就越明顯。本研究結果顯示，游泳后中、高劑量給藥組的血清尿素氮含量水平顯著低于對照組(P＜0.01)(見表5)，提示新疆野生黨參黃酮類化合物能使小鼠的運動負荷能力提高，不易發(fā)生疲勞。

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