藍(lán)莓提取物對(duì)副溶血性弧菌的抑制作用

謝慶超，孫曉紅*，沈 瀟，Vivian C.H.Wu，潘迎捷

1上海海洋大學(xué)食品學(xué)院上海水產(chǎn)品加工及貯藏工程技術(shù)研究中心，上海201306; 2美國(guó)緬因大學(xué)食品科學(xué)與人類營(yíng)養(yǎng)系，緬因04469

副溶血性弧菌(又稱嗜鹽菌，Vibrio parahaemolyticus)作為常見的食源性致病菌之一，廣泛地分布于蝦、蟹等海產(chǎn)品中，人們食用經(jīng)副溶血性弧菌污染的海產(chǎn)品后易產(chǎn)生腹瀉等腸胃疾病。以2007年上海市腸道疾病調(diào)查為例，由食源性致病菌導(dǎo)致的腸道疾病占總腸道疾病的12.82%，其中副溶血性弧菌引發(fā)的疾病占76.92%［1］。曹慧慧等［2］對(duì)國(guó)內(nèi)8個(gè)沿海城市大型水產(chǎn)品批發(fā)市場(chǎng)零售的貝類產(chǎn)品檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，62.67%的樣品呈tlh陽性，即存在副溶血性弧菌污染。由于副溶血性弧菌多存在于海水中，進(jìn)入海產(chǎn)品后很難被清除，人們又喜愛食用生或者半生的海產(chǎn)品，因此明顯加劇了感染副溶血性弧菌的風(fēng)險(xiǎn)。

目前常用的水產(chǎn)品保鮮劑如山梨酸鉀等化學(xué)保鮮劑由于其安全衛(wèi)生問題引起人們的擔(dān)憂，因此，具有抑菌功能的天然活性物質(zhì)開始受到人們的重視［3-5］。藍(lán)莓，又稱越橘，不僅具有良好的營(yíng)養(yǎng)保健作用，還具有防止腦神經(jīng)衰老［6］、增強(qiáng)心臟功能、明目及抗癌等獨(dú)特功效，因此被國(guó)際糧農(nóng)組織列為人類五大健康水果之一。目前國(guó)內(nèi)外對(duì)藍(lán)莓活性物質(zhì)研究集中在花青素［7］的分離提取和對(duì)人體功能、消化吸收及體內(nèi)代謝等方面，對(duì)藍(lán)莓的抑菌活性研究少有報(bào)道。目前已見報(bào)道的研究?jī)H有:Ofek等［8］研究發(fā)現(xiàn)藍(lán)莓汁可破壞大腸桿菌細(xì)胞膜，造成菌體受損死亡。QIU等［9］用藍(lán)莓提取液處理漢堡中的牛肉能顯著延長(zhǎng)漢堡的貨架期，且其感官品質(zhì)未明顯變化。陳玉峰等［10］研究發(fā)現(xiàn)，藍(lán)莓果實(shí)中的花色苷對(duì)大腸桿菌有一定的抑制作用。然而，藍(lán)莓對(duì)副溶血性弧菌的抑制作用尚未見報(bào)道。基于此，本文優(yōu)化了藍(lán)莓抑菌活性物質(zhì)的提取工藝，并對(duì)副溶血性弧菌的抑菌效果進(jìn)行研究，為藍(lán)莓天然生物保鮮劑的開發(fā)利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

1.1.1 材料

藍(lán)莓(Vaccinium corymbosum L.)品種為高叢藍(lán)莓(High bush blueberry)埃利奧特(Alliot)，購自沃林(Wallin)農(nóng)業(yè)青島有限公司，保存于-20℃冰箱。

副溶血性弧菌ATCC33847購自于美國(guó)ATCC菌種保藏中心。

1.1.2 試劑

無水乙醇(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)，TSB (3%NaCl)培養(yǎng)基與TCBS培養(yǎng)基(北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司)。

1.1.3 主要儀器

8010s勻漿機(jī)(Waring Commerial)，pl2002電子天平(Mettler Toledo)，SK5200HP超聲波清洗機(jī)(上?？茖?dǎo)超聲波儀器有限公司)，GG17旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(SENCO)，QB9006微孔板快速振蕩器(金壇市醫(yī)療儀器廠)，3799 96孔板(Corning Incorporated)。

1.2 方法

1.2.1 工藝流程

稱取藍(lán)莓5 g→快速解凍→勻漿→超聲波提取→離心→布氏漏斗過濾→0.22 μm濾膜過濾→旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至5 mL(其濃度即為1 g/mL)放于-20℃?zhèn)溆谩?/p>

由于進(jìn)行的是抑菌效果的驗(yàn)證，因此未考慮增加提取次數(shù)以提高得率。

1.2.2 超聲波法提取藍(lán)莓有效成分正交試驗(yàn)［11］

進(jìn)行三因素四水平正交試驗(yàn)，按正交表L16(43)對(duì)乙醇濃度、提取溫度、提取時(shí)間進(jìn)行研究，每個(gè)因子4個(gè)水平，每個(gè)處理3次重復(fù)，具體見表1。

表1 正交試驗(yàn)因素水平表Table 1 Design of orthogonal experiment

1.2.3 藍(lán)莓提取物pH值測(cè)定

采用pH計(jì)測(cè)定16種提取方法得到的藍(lán)莓提取物的pH值。

1.2.4 副溶血性弧菌菌液制備

取斜面保藏的菌株，用TSB(3%NaCl)培養(yǎng)基活化兩次。取1 μL菌液加入到10 mL TSB(3% NaCl)培養(yǎng)基中進(jìn)行稀釋，使菌液濃度達(dá)到 104CFU/mL。

1.2.5 藍(lán)莓提取物對(duì)副溶血性弧菌抑制實(shí)驗(yàn)［12］

每個(gè)處理各取100 μL濃度分別為100和40 mg/mL的藍(lán)莓提取液(1 g/mL原液經(jīng)無菌水稀釋)加入到96孔板兩個(gè)孔中，再各取100 μL稀釋后的菌液與藍(lán)莓提取液混合，30℃振蕩培養(yǎng)24 h。每個(gè)孔各取100 μL混合液涂布于TCBS培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)24 h，計(jì)算每毫升菌落數(shù)。陽性對(duì)照采用100 μL山梨酸鉀(0.5 g/kg)與菌液混合，空白對(duì)照采用無菌水代替藍(lán)莓提取液與菌液混合(等同于陰性對(duì)照)。每個(gè)處理兩個(gè)平行，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.6 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均采用三次平行實(shí)驗(yàn)的平均值，數(shù)據(jù)用Excel軟件處理，數(shù)據(jù)間的差異通過統(tǒng)計(jì)軟件SPSS13.0進(jìn)行單因變量多因素方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同提取條件下藍(lán)莓提取物抑菌正交試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 16種藍(lán)莓提取物抑菌效果

采用不同條件提取獲得的100和40 mg/mL的藍(lán)莓提取液對(duì)副溶血性弧菌的抑菌效果如表2所示，當(dāng)藍(lán)莓提取物濃度為100 mg/mL時(shí)，處理組合A1B2C2、A1B4C4、A2B1C2、A2B2C3、A3B1C3、A3B2C4、A3B3C1和A3B4C2的抑菌率為100%，無法進(jìn)行組內(nèi)的有效比較。因此以40 mg/mL藍(lán)莓提取物的抑菌率為考察指標(biāo)，綜合各因素K值結(jié)果，得出理論上最優(yōu)條件為A4B3C1。影響藍(lán)莓抑菌效果的因素排序?yàn)?C＞B＞A，即提取溫度＞超聲波時(shí)間＞乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)。

2.1.2 不同因素對(duì)藍(lán)莓提取物抑菌效果影響的比較

以抑菌率作為因變量，采用SPSS13.0對(duì)藍(lán)莓提取物濃度為40 mg/mL的實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行單因變量多因素方差分析，同時(shí)使用F檢驗(yàn)對(duì)比三次重復(fù)，結(jié)果表明重復(fù)間差異不顯著。從表3可以看出，C因素(溫度)間差異顯著(p=0.024)，說明不同的提取溫度對(duì)藍(lán)莓提取物抑菌效果影響最大，B因素(時(shí)間)間差異顯著(p=0.069)，說明不同提取時(shí)間藍(lán)莓提取物抑菌效果影響比較大，A因素(乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù))間差異不顯著(p=0.710)，藍(lán)莓提取物抑菌效果影響不大，分析結(jié)果與正交試驗(yàn)結(jié)果一致。B因素和C因素各水平間均達(dá)到差異顯著，說明提取溫度和時(shí)間的不同對(duì)藍(lán)莓抑菌活性有顯著的差異，需進(jìn)行區(qū)組內(nèi)的多重比較。

表2 16種提取方法所得藍(lán)莓提取物的24 h抑菌率Table 2 Inhibitory rate after 24 h under the 16 extract methods of blueberry

表3 抑菌效果的方差分析Table 3 Analysis of variance with the results of 24h inhibitory effects

2.1.3 最優(yōu)提取條件的獲得

以抑菌率作為評(píng)估標(biāo)準(zhǔn)，采用SPSS13.0進(jìn)行各因素內(nèi)不同水平的多重比較。圖1中顯示的是各因素內(nèi)估計(jì)邊際均值的比較，可以比較各水平的邊際均數(shù)。由于實(shí)驗(yàn)中是以抑菌率作為因變量，因此均值越高則表明抑菌效果越好。由圖1可以看出，A3、B3、C1在各自因素內(nèi)有最好的抑菌效果，因此最優(yōu)組合為A3B3C1，即采用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為65%的乙醇溶液作為提取劑，超聲波提取25 min，提取溫度為30℃所得到的藍(lán)莓提取物抑菌效果最佳。為比較正交試驗(yàn)獲得的最優(yōu)組合與SPSS13.0分析獲得的最優(yōu)組合，按照兩種提取方法重復(fù)提取3次，測(cè)得A4B3C1的抑菌率為78.2%，A3B3C1為81.3%，表明乙醇濃度65%，超聲波提取時(shí)間25 min，提取溫度30℃是最優(yōu)的提取條件。

圖1 24 h抑菌效果的多重比較結(jié)果Fig.1 Multiple comparisons with the results of inhibitory rate

2.2 不同提取條件下藍(lán)莓提取物pH值

通過比較16組藍(lán)莓提取物的pH值可以看出，第11組pH值最低，僅為2.764，第3組pH值最高，達(dá)到了2.984。針對(duì)pH值較低的問題，又添加一組與最低pH值相同的HCl溶液作為處理液處理同樣菌數(shù)的副溶血性弧菌，結(jié)果發(fā)現(xiàn)處理24 h后，菌數(shù)高達(dá)7.11 log CFU/mL，將提取物pH值回調(diào)至7，再次研究其抑菌效果，發(fā)現(xiàn)提取物無抑菌效果，說明藍(lán)莓提取物的抑菌活性與提取物中的酸性物質(zhì)沒有直接關(guān)系。但本實(shí)驗(yàn)得到的抑菌最優(yōu)組合同時(shí)具有相對(duì)較低的pH值，可能藍(lán)莓中的活性物質(zhì)要在低pH值下才能發(fā)揮最好的抑菌效果。

圖2 16種提取方法所得藍(lán)莓提取物的pH值測(cè)定結(jié)果Fig.2 pH determination under the 16 extraction methods of China Blueberry

3 討論及結(jié)論

孟凡麗［13］、楊桂霞［14］和柳嘉［15］分別提取并鑒定了藍(lán)莓果中花色苷、黃酮及多酚類物質(zhì)。其中，花色苷是藍(lán)莓提取物的主要著色成分，在較低的pH下花色苷才有較高的穩(wěn)定性。本研究中我們也推測(cè)提取物中可能包含有一些酚酸類物質(zhì)。在今后的實(shí)驗(yàn)中可以對(duì)提取物進(jìn)行分離純化，鑒定其主要成分，并研究各成分的抑菌功能。

近年來我國(guó)發(fā)生的食品安全事件層出不窮，透過這些事件，消費(fèi)者對(duì)食品加工過程中使用的防腐保鮮手段感到極大恐懼。因此，如何讓人們食用安全健康的食品是我國(guó)廣大食品生產(chǎn)廠家以及科研工作者認(rèn)真面對(duì)的問題?；谔烊换钚晕镔|(zhì)而開發(fā)新的防腐保鮮手段是最優(yōu)也是最合理的解決方法。對(duì)于水產(chǎn)品，也有人研究了一些生物保鮮手段用以取代傳統(tǒng)的化學(xué)保鮮方法。Fan［16］等人的研究表明在-3℃條件下噴淋0.2%的茶多酚能有效延長(zhǎng)白鰱魚的保鮮期，但是茶多酚很容易被氧化而且脂溶性不很理想，因此限制了其發(fā)展。王秀娟［17］等人研究了殼聚糖涂膜對(duì)蝦的保鮮作用，發(fā)現(xiàn)保質(zhì)期比未涂抹的蝦延長(zhǎng)了2～3 d，但殼聚糖保鮮膜效率低、難干燥、制膜強(qiáng)度差，且殼聚糖本身的澀味也降低了其使用率。本研究中得到的藍(lán)莓提取物可以有效抑制副溶血性弧菌的生長(zhǎng)，脂溶性好，本身具有清香，能改善口味，同時(shí)還具有抗氧化抗衰老等營(yíng)養(yǎng)功能，缺點(diǎn)則是需要較低的pH值環(huán)境。

本研究以北高叢藍(lán)莓中的栽培品種埃利奧特為材料，利用三因素四水平正交實(shí)驗(yàn)提取抑菌活性物質(zhì)，最終確定最優(yōu)提取條件是65%的乙醇(w/w)作為提取劑、溫度為30℃，超聲波時(shí)間為25 min。影響藍(lán)莓抑菌效果的因素排序?yàn)?提取溫度＞超聲波時(shí)間＞乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)。本研究為進(jìn)一步研究藍(lán)莓提取物對(duì)真實(shí)樣品的抑菌效果及對(duì)副溶血性弧菌的抑菌機(jī)理研究提供了依據(jù)。

1 Shen AM(沈安梅).Monitoring of infectious diarrhea in Nanhui District，Shanghai，2007.Shanghai J Prev Med(上海預(yù)防醫(yī)學(xué)雜志)，2008，12:592-593.

2 Cao HH(曹慧慧)，Zhao F(趙峰)，Yu WC(于維森)，et al.Quantitative inspection and analysis of Vibrio parahaemolyticus contamination in shellfish in eight coastal cities in China.Chin J Health Lab Technol(中國(guó)衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志)，2010，4: 723-725，730.

3 Sallam KI，Ishioroshi M，Samejima K.Antioxidant and antimicrobial effects of garlic in chicken sausage.Lebenson Wiss Technol，2004，37:849-855.

4 Zhu YN(朱永寧)，Yuan YL(袁玉蓮)，Zhang XP(張小坡)，et al.Effect of green tea and sucrose in the restrain bacterium and keep fresh meat.Food Sci Technol(食品科技)，2005，11:66-69.

5Xu HJ(徐紅娟)，Mo ZH(莫志宏)，Yu JW(余佳文)，et al.Separation and purification of anti-fungal compound from Cordyceps cicadae.Nat Prod Res Dev(天然產(chǎn)物研究與開發(fā))，2010，22:794-797，835.

6 Wilson MA，Shukitt-Hale B，Kalt W，et al.Blueberry polyphenols increase lifespan and thermotolerance in Caenorhabditis elegans.Aging Cell，2006，5:59-68.

7 Ishikawa F，Oishi M，Shindo T，et al.Analysis of anthocyanins in dietary supplements containing Blueberry extract.Shokuhin Eiseigaku Zasshi，2008，49:339-346.

8 Ofek I，Goldhar J，Zafriri D，et al.Anti-Escherichia coli adhesin activity of cranberry and blueberry juices.N Engl J Med，991，324:1599.

9 Qiu XJ，Wu VCH.Evaluation of Escherichia coli O157:H7，Listeria mmonocytogenes，Salmonella typhimurium and Staphylococcus aureus in ground beef with cranberry concentrate by thin agar layer method.J Rapid Methods Automat Microbiol，2007，15:282-294.

10 Chen YF(陳玉峰)，Wang RF(王瑞芳)，Li Z(李政)，et al.Study of stability and antibacterial activity of cranberry fruit pigment.J Southwest Univ(Nat Sci Ed)(西南大學(xué)學(xué)報(bào))， 2008，2:113-118.

11 Tong LL(佟琳琳)，Meng FL(孟凡麗)，Li YD(李亞東)，et al.Ultrasound extraction of anthocyanins extracted from the fruit of Blueberry.Farm Prod Proc(農(nóng)產(chǎn)品加工)，2009，5: 73-75.

12 Su MS，Chien PJ.Antioxidant activity，anthocyanins，and phenolics of rabbit eye blueberry(Vaccinium ashei)fluid products as affected by fermentation.Food Chem，2007，104:182-187.

13 Meng FL(孟凡麗).Extraction，modification of Genistein in Huaijiao and HPLC analysis of three CTM.Changchun:Jilin Agriculture University(吉林農(nóng)業(yè)大學(xué))，PhD.2003.

14 Yang GX(楊桂霞)，F(xiàn)an HL(范海林)，Zheng YN(鄭毅男)，et al.Separation and identification of the flavoniods in the fruit of Vaccinium uliginosum L.blueberry.J Jilin Agric Univ(吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào))，2005，27:643-644，648.

15 Liu J(柳嘉)，Zhao J(趙競(jìng))，Jing H(景浩).Composition analysis and antioxidant activity of bog bilberry polyphenol extract.Food Sci Technol(食品科技)，2009，9:220-224.

16 Fan WJ，Chi YL，Zhang S.The use of a tea polyphenoldip to extend the shelf life of silver carp(Hypophthalmicthys molitrix)during storage in ice.Food Chem，2008，108:148-153.

17 Wang XJ(王秀娟)，Zhang KS(張坤生)，Ren YX(任云霞).Study on effects of additive to the preservation of shrimp by coating with chitosan.Food Sci Technol(食品科技)，2008，7:239-242.