凹葉厚樸抑制α-糖苷酶與抗氧化活性研究

曹乃鋒，康文藝

1河南大學(xué)中藥研究所;2河南大學(xué)研究生院，開封475004

凹葉厚樸 (Magnolia Officinalis Rehder et Wils.)為木蘭科木蘭屬植物，藥用干皮、枝皮及根皮。其性溫、味苦、辛。具燥濕消痰、下氣除滿之功效，用于濕滯傷中、脫痞吐瀉、食積氣滯、腹脹便秘、痰飲喘咳［1］。主要成分為厚樸酚 (magnolol)與和厚樸酚(honokiol)［2］，包括異喹啉類生物堿以及揮發(fā)油［3-5］。Lee等［6］2009年報道了厚樸正丁醇提取物和4-O-甲基和厚樸酚具有抗氧化和保護神經(jīng)的作用;Choi等［7］2009年報道了厚樸酚通過激活PPARr配體來提高胰島素的敏感性;Park J等［8］報道了厚樸具有廣譜抗菌等作用;Young Sook Kim等［9］通過研究發(fā)現(xiàn)高糖和S100b蛋白可誘導(dǎo)TGF-β1和纖維連接蛋白的表達(dá)，但厚樸酚能通過人體視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞的ERK/MAPK/AKt信號通道來抑制這種增強的表達(dá)。Kenji I等［10］研究發(fā)現(xiàn)和厚樸酚在骨髓的微環(huán)境內(nèi)能夠抑制血管形成，并且能夠殺死耐藥的多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞。

本文對貴州與河南產(chǎn)凹葉厚樸抑制α-葡萄糖苷酶活性和總抗氧化能力進行研究。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

凹葉厚樸分別于2008年7月采集于河南省桐柏山，2009年7月采集于貴州省貴陽市。分別經(jīng)河南大學(xué)天然藥物研究所生藥教研室李昌勤副教授和貴陽中醫(yī)學(xué)院劉凡教授鑒定為木蘭科木蘭屬植物Magnolia Officinalis Rehder et Wils，標(biāo)本存于河南大學(xué)中藥研究所。

α-葡萄糖苷酶(α-glucosidase，EC 3.2.1.20);4-硝基苯-α-D-吡喃葡萄糖苷(4-N-trophenyl-α-D-glucopyranoside，PNPG，026K1516);阿卡波糖(Acarbose，Lot 16869)和二甲亞砜(DMSO)均購自美國Sigma公司。DPPH(日本東京化成工業(yè)株式會社)，ABTS(Fluka)，F(xiàn)e3+-三吡啶三啞嗪(tripyridyl-triazine，TPTZ)、沒食子酸丙酯(propyl gallate，PG)、丁基羥基茴香醚(Butylatedhydr oxyanisole，BHA)、二丁基羥基甲苯(Butylatedhydr oxyt oluene或2，6-Ditert-butyl-4-methyl phenol，BHT)(Acros organics)，6-羥基2，5，7，8-四甲基苯并二氫吡喃-2-羧酸 (6-hydroloxy-2，5，7，8-tetramethyl-chroman-2-carboxylic acid，Tr olox)(Aldrich)。

1.2 儀器

Multiskan MK3酶標(biāo)儀(美國Thermo Electron公司);LRH-150恒溫培養(yǎng)箱(上海一恒科技有限公司);DELTA 320型PH計(美國Mettler-Toledo公司)。

1.3 凹葉厚樸浸膏的提取

貴州產(chǎn)凹葉厚樸葉325 g和河南產(chǎn)凹葉厚樸葉202 g分別干燥、粉碎后，用甲醇室溫下冷浸3次，每次7天。合并提取液后濃縮，浸膏分散水中，依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取，分別得到石油醚提取物8.6和4.1 g、乙酸乙酯提取物12.5和6.1 g、正丁醇提取物12.5和10.7 g。

1.4 α-葡萄糖苷酶抑制活性的篩選方法

以康文藝等［11］建立的96微孔板篩選方法，405 nm處檢測其OD值。并按照以下公式求出酶活性抑制率。

然后用Origin軟件，以質(zhì)量濃度為橫軸，抑制率為縱軸作圖，求出相應(yīng)的半數(shù)抑制濃度(IC50值)。

1.5 抗氧化活性測定方法

DPPH法:按照文獻(xiàn)［12］的方法，在 515 nm處檢測樣品吸光度;ABTS法:按照文獻(xiàn)［13］的方法，在734 nm處檢測樣品吸光度;FRAP法:按照文獻(xiàn)［12］的方法，在 593 nm處檢測樣品吸光度，結(jié)果以 c (Trolox)表示。

2 結(jié)果與討論

2.1 貴州與河南產(chǎn)凹葉厚樸α-葡萄糖苷酶抑制活性

2.1.1 提取物活性的篩選

所有提取部位中，貴州產(chǎn)凹葉厚樸葉乙酸乙酯的α-葡萄糖苷酶的抑制活性最高(IC50=7.22 μg/ mL)，其正丁醇提取部位(IC50=36.59 μg/mL)、河南產(chǎn)凹葉厚樸石油醚部位(IC50=107.04 μg/mL)和乙酸乙酯部位(IC50=17.17 μg/mL)的活性均高于陽性對照Acarbose(IC50=1081.27 μg/mL)。

2.1.2 提取物濃度對α-葡萄糖苷酶抑制活性的影響

圖1顯示，凹葉厚樸提取物的α-葡萄糖苷酶抑制活性呈劑量依賴性，而且，當(dāng)抑制率達(dá)到一定程度時，再增加提取物質(zhì)量濃度，抑制活性不會提高。其中，貴州產(chǎn)凹葉厚樸乙酸乙酯提取物和正丁醇提取物在0.4 mg/mL時，達(dá)到最大抑制率，再增加提取物濃度，抑制率不再變化。河南產(chǎn)凹葉厚樸石油醚提取物和乙酸乙酯提取物在0.8 mg/mL時達(dá)到最大抑制率。

圖1 提取物濃度對α-葡萄糖苷酶活性的影響Fig.1 The mass concentration of extracts effect on α-glucosidase inhibitory activity

2.2 貴州與河南產(chǎn)凹葉厚樸抗氧化活性

2.2.1 DPPH法

凹葉厚樸6個提取部位中，石油醚部位(河南)清除DPPH自由基的能力最強 (IC50=13.63 μg/ mL)，乙酸乙酯部位(貴州)次之(IC50=13.74 μg/ mL)。河南與貴州產(chǎn)凹葉厚樸提取部位與陽性對照PG、BHA、BHT對 DPPH自由基的清除能力順序為:PG(IC50=0.81 μg/mL)＞BHA(IC50=2.28 μg/mL)＞BHT(IC50=3.69 μg/mL)＞正丁醇部位(河南)(IC50=13.63 μg/mL)＞乙酸乙酯部位(貴州)(IC50=13.74 μg/mL)＞乙酸乙酯部位(河南)(IC50=20.21 μg/mL)＞正丁醇部位(貴州)(IC50=44.49 μg/mL)。

圖2顯示，河南產(chǎn)凹葉厚樸正丁醇提取物清除DPPH自由基的能力強于貴州產(chǎn)凹葉厚樸正丁醇提取物;河南產(chǎn)凹葉厚樸乙酸乙酯提取物清除DPPH自由基的能力與貴州產(chǎn)凹葉厚樸乙酸乙酯提取物能力相當(dāng);但弱于陽性對照PG、BHA和BHT。在實驗濃度范圍內(nèi)，河南和貴州產(chǎn)凹葉厚樸乙酸乙酯提取物質(zhì)量濃度在25 μg/mL以下時，DPPH自由基清除率隨質(zhì)量濃度增大幾乎呈線性增加，當(dāng)質(zhì)量濃度在25 μg/mL以上時，清除率幾乎不變。貴州和河南產(chǎn)凹葉厚樸乙酸乙酯提取物清除DPPH自由基的能力與其濃度呈線性關(guān)系(相關(guān)系數(shù)分別為0.99765和0.99552)。

圖2 抗氧化劑質(zhì)量濃度對DPPH自由基的影響Fig.2 Effect of mass concentration of antioxidant on DPPH free radical

2.2.2 ABTS法

乙酸乙酯部位(貴州)清除ABTS自由基的能力最強(IC50=8.81 μg/mL)。河南與貴州產(chǎn)凹葉厚樸提取物與陽性對照PG、BHA、BHT對ABTS自由基的清除能力順序為:PG(IC50=0.74 μg/mL)＞BHA(IC50=2.28 μg/mL)＞乙酸乙酯部位(貴州)(IC50=8.81 μg/mL)＞BHT(IC50=11.94 μg/mL)＞乙酸乙酯部位(河南)(IC50=12.73 μg/mL)＞正丁醇部位(河南)(IC50=15.72 μg/ mL)＞正丁醇部位(貴州)(IC50=29.12 μg/mL)。

圖3顯示，在實驗濃度范圍內(nèi)，乙酸乙酯提取物(貴州)清除ABTS自由基的能力最強。在質(zhì)量濃度為25 μg/mL時，清除率已達(dá)到100%且清除ABTS自由基的能力與其濃度呈正量效關(guān)系 (r= 0.98979);在相同質(zhì)量濃度下，乙酸乙酯提取物(河南)和PG清除ABTS自由基的能力相近，并且與其濃度呈線性關(guān)系 (相關(guān)系數(shù)分別為 0.99557和0.99854);正丁醇提取物(河南)在質(zhì)量濃度為25 μg/mL以下時，ABTS自由基清除率隨質(zhì)量濃度增大幾乎呈線性增加(r=0.9769)，在25 μg/mL以上時，清除率趨于平緩。

圖3 抗氧化劑質(zhì)量濃度對ABTS自由基的影響Fig.3 Effect of mass concentration of antioxidant on ABTS free radical

2.2.3 FRAP(鐵離子還原能力)法

提取部位與陽性對照PG、BHA、BHT還原Fe3+能力順序為:PG(FRAP值=16330.04 μmolTE/g)＞PHA(FRAP值=8040.13 μmolTE/g)＞BHT (FRAP值=2372.34 μmolTE/g)＞乙酸乙酯提取物(貴州)(FRAP值=952.15 μmolTE/g)＞乙酸乙酯提取物(河南)(FRAP值=856.67 μmolTE/g)＞正丁醇提取物(河南)(FRAP值 =952.15 μmolTE/g)＞正丁醇提取物(貴州)(FRAP值= 356.53 μmolTE/g)＞石油醚提取物(河南)(FRAP值=131.25 μmolTE/g)＞石油醚提取物(貴州) (FRAP值=121.03 μmolTE/g)。表明乙酸乙酯提取物(貴州)還原Fe3+的能力最強(FRAP值=952.15 μmolTE/g);其次為乙酸乙酯提取物(河南) (FRAP值=856.67 μmol TE/g)。

3 結(jié)論

首次對凹葉厚樸的α-葡萄糖苷酶抑制活性研究，發(fā)現(xiàn)貴州產(chǎn)凹葉厚樸乙酸乙酯提取部位α-葡萄糖苷酶抑制活性最好。就產(chǎn)地而言，貴州產(chǎn)凹葉厚樸乙酸乙酯提取部位和正丁醇提取部位的α-葡萄糖苷酶抑制活性高于河南產(chǎn)凹葉厚樸乙酸乙酯提取部位和正丁醇提取部位。

對凹葉厚樸體外抗氧化活性進行考察，發(fā)現(xiàn)貴州產(chǎn)凹葉厚樸乙酸乙酯提取部位還原Fe3+能力最強，河南產(chǎn)凹葉厚樸乙酸乙酯提取部位次之。就產(chǎn)地而言，貴州產(chǎn)凹葉厚樸乙酸乙酯提取部位清除DPPH、ABTS自由基的能力和還原Fe3+能力均好于河南產(chǎn)的;但河南產(chǎn)凹葉厚樸正丁醇提取部位清除DPPH、ABTS自由基的能力和還原Fe3+能力均高于貴州產(chǎn)的。

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