駱駝蓬種子中一種具抗腫瘤活性蛋白的分離純化及鑒定

馬曉瑾，吳 婷，羅晶晶，王 燕，李 陽，劉東亮，孫素榮

新疆大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院新疆生物資源基因工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，烏魯木齊830046

脂轉(zhuǎn)移蛋白(lipid transfer proteins，LTPs)是一類分子量相對(duì)較小的堿性蛋白質(zhì)，在植物、動(dòng)物、酵母、真菌和一些細(xì)菌中均有發(fā)現(xiàn)［1］。在植物中僅發(fā)現(xiàn)有非特異性脂轉(zhuǎn)移蛋白(non-specific lipid transfer proteins，nsLTPs)。根據(jù)分子量的不同，植物脂轉(zhuǎn)移蛋白可分為三類。第一類是nsLTPI，分子量大約為9 kDa;第二類是nsLTPII，分子量大約為7 kDa;另外，還有一些研究發(fā)現(xiàn)了一些分子量大于10 kDa的脂轉(zhuǎn)移蛋白［2，3］?，F(xiàn)已從多種植物中分離得到LTPs，如玉米［4］、水稻［5］、甜桔［6］、籮卜［7］、擬南芥［8］等。由于植物nsLTPs具有很強(qiáng)的抗真菌和細(xì)菌的活性，所以被列為植物防御蛋白系列。然而近年來一些研究還發(fā)現(xiàn)植物nsLTPs還具有較強(qiáng)的抗腫瘤活性，2007年P(guān)eng Lin［9］等人研究發(fā)現(xiàn)nsLTPs涉及細(xì)胞程序性死亡;蕓苔屬的脂轉(zhuǎn)移蛋白(LTP)能抑制肝癌細(xì)胞Hep G2和乳腺癌MCF 7細(xì)胞的增殖; 2008年Linda S.M.Ooi［10］等人從水仙花中分離出的脂轉(zhuǎn)移蛋白NTP能抑制急性前髓性白血病(HL-60)細(xì)胞的增殖。由于脂轉(zhuǎn)移蛋白表現(xiàn)出的多種生物學(xué)活性，目前已引起很多學(xué)者的廣泛關(guān)注。

本研究的實(shí)驗(yàn)材料為駱駝蓬(Peganum harmala)，是蒺藜科(Zygophyllaceae)駱駝蓬屬(Peganum)的一種多年生草本植物，已列入維吾爾藥衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)［11］。目前的研究表明，駱駝蓬富含多種生物堿，具有抗癌、消炎和抗病毒等多種藥理及殺蟲抑菌活性［12-14］，但關(guān)于駱駝蓬活性蛋白的研究?jī)H見于本課題組對(duì)其蛋白粗提物的活性研究［15］，駱駝蓬活性蛋白的分離純化和活性的研究尚未見報(bào)道。因此，本文從駱駝蓬種子中分離純化出抗腫瘤作用較強(qiáng)的脂轉(zhuǎn)移蛋白并初步研究其抗腫瘤活性，可為進(jìn)一步研究其抗腫瘤機(jī)制及抗腫瘤新藥的研制開發(fā)提供基礎(chǔ)資料。

1 材料與方法

1.1 材料

駱駝蓬種子采自烏魯木齊紅雁池水庫。宮頸癌HeLa、食管癌Eca109、肝癌BEL-7404、胃癌MGC-7和非洲綠猴腎細(xì)胞Vero細(xì)胞購自中科院上海細(xì)胞庫。CM陽離子交換層析柱，Superdex 75凝膠過濾層析柱購自GE公司，HPLC Columns購自Agilent公司。細(xì)胞培養(yǎng)基購自GIBCO公司，MTT購自SIGMA公司，Bradford蛋白檢測(cè)試劑盒，其他試劑為國產(chǎn)分析純。AKTA purifier蛋白純化儀購自GE公司，電泳設(shè)備購自北京六一儀器廠，CHRIST凍干和CO2培養(yǎng)箱購自北京五洲東方科技公司，生物安全柜購自HEAL FORCE，熒光顯微鏡為L(zhǎng)EICA CTR6000，酶標(biāo)儀購自美國Bio-Rad公司，高效液相層析儀購自日本Shima DZU公司。

1.2 方法

1.2.1 駱駝蓬蛋白的分離純化

稱取200 g干燥的駱駝蓬種子用粉碎機(jī)打成細(xì)粉，用預(yù)冷0.01 mol/L pH 7.2的PBS溶液2000 mL在4℃浸泡，磁力攪拌器攪拌12 h，5000 rpm，4℃離心15 min。上清液4層紗布過濾得棕色濾液，根據(jù)濾液體積加入硫酸銨調(diào)至飽和度為50%，去除蛋白沉淀，在澄清液中繼續(xù)加硫酸銨調(diào)至飽和度為80%進(jìn)行鹽析。最后把沉淀分別溶于少量PBS，并移至透析袋中，以相同緩沖液為透析液在4℃下透析脫鹽(每4～8 h左右換一次透析液)，直至用1%BaCl2檢測(cè)硫酸銨已完全除盡。最后將蛋白粗提液冷凍干燥，得到一定量的蛋白粗品干粉。

用0.01 mol/L，pH5.0的PBS緩沖液平衡CMSepharose柱。駱駝蓬蛋白粗品溶解過濾后，上柱，流速為0.5 mL/min。平衡緩沖液洗去未吸附的蛋白和色素，分別用包含0.1，0.2和1M NaCl的PBS緩沖液進(jìn)行分步洗脫，流速為1 mL/min。穿流峰和洗脫峰經(jīng)抑癌活性檢測(cè)，收集活性峰，保存于-20℃?zhèn)溆??；钚苑鍢悠方?jīng)濃縮后上樣于含0.15 mol/L NaCl的0.01 mol/L PBS(pH 7.2)預(yù)平衡的Superdex 75柱，流速為0.5 mL/min。收集活性峰，保存于-20℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 分子量測(cè)定

將純化的各組分進(jìn)行Tricine-SDS-PAGE電泳檢測(cè)其分子量［16］?？捡R斯亮藍(lán)R-250的染色，脫色后用凝膠成像系統(tǒng)對(duì)電泳結(jié)果進(jìn)行記錄并分析。高效液相色譜(HPLC)對(duì)駱駝蓬純化的蛋白組分進(jìn)行純度和表觀分子量檢測(cè)。柱型號(hào)為 TSK-G4000 PWxl，柱溫25℃，測(cè)波長(zhǎng)為280 nm，流動(dòng)相為0.05 mol/L PBS(pH 7.2)，溶劑為 0.05 mol/L PBS (pH7.2)，進(jìn)樣量為20 μL，流速為0.8 mL/min。分別取下列標(biāo)準(zhǔn)品作標(biāo)準(zhǔn)曲線方程:乳鐵蛋白71 kDa，卵清白蛋白44 kDa，碳酸酐酶29 kDa，β-乳球蛋白18 kDa，溶菌酶14 kDa。分析方法采用歸一法［17］。

1.2.3 N-端氨基酸序列測(cè)定

將純化蛋白進(jìn)行Tricine-SDS-PAGE電泳，再轉(zhuǎn)至PVDF膜上，經(jīng)考馬斯亮藍(lán)R-250染色后切膠，采用EDMAN降解法完成N-端氨基酸序列測(cè)定。將序列結(jié)果在蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫NCBI中作比對(duì)，進(jìn)行同源序列分析。

1.2.4 增殖抑制活性檢測(cè)

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，加到96孔板中，每孔加入100 μL，細(xì)胞密度為5×104個(gè)/孔。在5%CO2，37℃繼續(xù)孵育12 h至細(xì)胞貼壁，將不同濃度的駱駝蓬蛋白用滅菌PBS溶解，過濾除菌，每孔加100 μL，設(shè)5個(gè)重復(fù)孔。5%CO2，37℃孵育不同時(shí)間后倒置顯微鏡下觀察。棄去各孔液體，每孔加入20 μL 5 mg/ mL MTT溶液和80 μL培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)4 h。終止培養(yǎng)，小心吸去孔內(nèi)培養(yǎng)液。每孔加入100 μL二甲基亞砜，置搖床上低速振蕩10 min，使結(jié)晶物充分溶解。選擇 490 nm波長(zhǎng)處測(cè)量各孔的吸光值(OD490)。細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率(%)=(陰性對(duì)照組OD490－空白組 OD490)－(實(shí)驗(yàn)組 OD490－空白組OD490)/(陰性對(duì)照組 OD490－空白組 OD490)× 100%。根據(jù)藥物濃度與抑制率的反應(yīng)曲線，用作圖法求出半數(shù)抑制濃度(IC50)［18，19］。

1.2.5 細(xì)胞凋亡形態(tài)觀察［20］

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期HeLa細(xì)胞接種于6孔板中，過夜培養(yǎng)貼壁后，加入濃度為40 μg/mL的純化的蛋白PhLTP，作用24 h后收集細(xì)胞，用PBS洗一次，離心1200 rpm×5 min，棄上清。以4%多聚甲醛1 mL加入各孔固定20 min，離心1200 rpm×5 min，棄上清，再加入1 mL Hoechst 33258染色液(終濃度為10 μg/mL)，37℃避光孵育30 min，PBS洗三次，將6孔板置于LEICA DMI6000B型倒置熒光顯微鏡下隨機(jī)觀察5個(gè)視野，放大倍數(shù)為200倍并拍照。

1.2.6 數(shù)據(jù)處理

各組實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)測(cè)定均做3個(gè)平行實(shí)驗(yàn)，結(jié)果取其平均值。各組數(shù)據(jù)之間采用單因素方差分析，用t檢驗(yàn)進(jìn)行組間均數(shù)的比較，使用SPSS 13.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 駱駝蓬蛋白的分離純化

駱駝蓬蛋白粗提液經(jīng)硫酸銨沉淀獲得80%飽和度下析出的蛋白，經(jīng)透析除鹽后用CM陽離子交換層析分離得到4個(gè)組分，其中Co為穿流峰，Cx1、Cx2和Cx3(圖1)為不同鹽離子濃度線性洗脫峰。用MTT法檢測(cè)各分離組分(150 μg/mL)對(duì)HeLa細(xì)胞的抑制作用，選擇活性最強(qiáng)的洗脫峰Cx2進(jìn)行下一步分離純化。洗脫峰Cx2經(jīng)Superdex 75凝膠過濾層析再次分離后，得到2個(gè)分離組分，CX2S2(圖2)為活性較強(qiáng)的組分。收集該活性組分即為駱駝蓬純化蛋白PhLTP。從100 g駱駝蓬種子中經(jīng)硫酸銨沉淀、CM陽離子交換層析和Superdex 75凝膠過濾層析分離純化得到的PhLTP脂轉(zhuǎn)移蛋白的得率為1.05及純化倍數(shù)為95.38(表1)。

表1 駱駝蓬蛋白經(jīng)不同純化步驟獲得的色譜成分的得率Table 1 Yields of chromatographic fractions obtained at different steps of purification of P.harmala protein

2.2 分子量測(cè)定

圖3 Tricine-SDS-PAGE圖譜Fig.3 Tricine-SDS-PAGE profile of PhLTP

圖4 PhLTP的表觀分子量測(cè)定Fig.4 Native molecular mass estimation of PhLTP

將上步純化得到的駱駝蓬脂轉(zhuǎn)移蛋白經(jīng)Tricine-SDS-PAGE鑒定，PhLTP在7.5 kDa左右處有單一條帶(圖3)，采用高效液相層析(HPLC)檢測(cè)蛋白表觀分子量，按標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算PhLTP的分子量為14.8kDa(圖4)。

2.3 N-端氨基酸序列分析

PhLTP的 N-端 20個(gè)氨基酸的序列為ITCPQVTQSLAPCVPYLISG。采用BLAST法在NCBI數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對(duì)，分析顯示該序列與與多種植物的脂轉(zhuǎn)移蛋白具有很高的同源性，其中與甜橙的N端序列同源性最高為75%，其次是大戟70%，油菜70%，歐洲板栗50%(表2)。因此，將該純化蛋白命名為駱駝蓬脂轉(zhuǎn)移蛋白(P.harmala lipid transfer proteins)。

表2 PhLTP與其他脂轉(zhuǎn)移蛋白的N端氨基酸序列比較Table 1 N-terminal sequence of PhLTP with those of lipid transfer protein from other species

2.4 增殖抑制活性和誘導(dǎo)凋亡

不同濃度的PhLTP處理HeLa、Eca-109、MGC-9和BEL-7404細(xì)胞48 h后，計(jì)算其對(duì)幾種癌細(xì)胞的抑制率。表3結(jié)果顯示PhLTP對(duì)幾種癌細(xì)胞具有明顯的抗增殖的作用(P＜0.01)，并且呈劑量依賴性。相比Eca-109、MGC-9和BEL-7404細(xì)胞，該蛋白對(duì)HeLa細(xì)胞的抗增殖作用比較明顯，作用48 h時(shí)，其IC50為45 μg/mL。PhLTP對(duì)正常細(xì)胞Vero的影響較小。進(jìn)一步研究PhLTP對(duì)HeLa細(xì)胞作用不同時(shí)間和不同濃度的影響，結(jié)果表明PhLTP對(duì)其對(duì)HeLa細(xì)胞的抑制作用具有時(shí)間和濃度依賴性(圖5)。

表3 PhLTP對(duì)五種細(xì)胞的增殖抑制Table 3 Inhibition of PhLTP towards five cell lines

熒光顯微鏡下觀察PhLTP對(duì)HeLa細(xì)胞的作用，從圖6可見陰性對(duì)照組的細(xì)胞平鋪貼壁生長(zhǎng)，細(xì)胞之間排列緊密，呈現(xiàn)不規(guī)則多角形;而PhLTP處理組細(xì)胞數(shù)量少，形態(tài)輪廓變得不清晰，細(xì)胞明顯變圓，且皺縮變形，細(xì)胞間連接減少，細(xì)胞脫壁而至懸浮狀態(tài)。熒光顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)陰性對(duì)照組細(xì)胞核染色均勻，PhLTP處理組細(xì)胞核染色加深，核固縮，并有凋亡小體形成。說明PhLTP能夠誘導(dǎo)HeLa細(xì)胞的凋亡。

3 討論

目前，中藥抗腫瘤有效成分越來越多地被開發(fā)出來，據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)，占抗癌藥的32.25%的是源于植物藥的抗癌制劑［20］，相對(duì)于化療藥物，中藥抗腫瘤具有安全、低毒、副作用小、遺傳致突變率低［21］等優(yōu)點(diǎn)。因此，從天然藥用植物中尋找具有抗腫瘤作用的新藥物，已成為抗腫瘤新藥研究和開發(fā)的一條重要途徑。本文從傳統(tǒng)維藥駱駝蓬種子中通過一系列生物化學(xué)方法篩選獲得了一種具有較強(qiáng)抗腫瘤活性的蛋白PhLTP。經(jīng)SDS-PAGE和HPLC檢測(cè)，它由二個(gè)相同的亞基組成，表觀分子量大約為14.8 kDa。通過 N末端前20個(gè)氨基酸序列測(cè)定及與GenBank登錄的脂轉(zhuǎn)移蛋白氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)，發(fā)現(xiàn)駱駝蓬蛋白與甜橙、大戟，油菜和歐洲板栗等的脂轉(zhuǎn)移蛋白具有較高的相似性，說明該蛋白是一種新的脂轉(zhuǎn)移蛋白。本發(fā)現(xiàn)可為PhLTP基因的克隆提供一定的條件，為將來進(jìn)一步將其研究開發(fā)成抗癌新藥或在農(nóng)業(yè)上研制轉(zhuǎn)基因植物奠定基礎(chǔ)。

圖6 顯微鏡觀察PhLTP誘導(dǎo)HeLa細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)變化Fig.6 PhLTP-induced morphologic changes in HeLa cells observed by microscopy

本實(shí)驗(yàn)純化的PhLTP具有一定的抗腫瘤活性，MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，PhLTP對(duì)多種癌細(xì)胞均具有抑制細(xì)胞增殖的作用，然而對(duì)正常細(xì)胞Vero的毒性較小，明顯低于其對(duì)腫瘤細(xì)胞的抑制率(P＜0.01)。說明其對(duì)正常細(xì)胞Vero的影響較小，細(xì)胞毒作用較低，初步體現(xiàn)其毒副作用小的藥用價(jià)值。

近年來，對(duì)脂轉(zhuǎn)移蛋白的抗癌活性的研究越來越多，例如從紅刺露兜樹［22］，芥藍(lán)［23］和水仙［10］等植物中得到的LTP都表現(xiàn)出抑制癌細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)凋亡的作用。本研究結(jié)果證實(shí)PhLTP能誘導(dǎo)HeLa細(xì)胞產(chǎn)生凋亡小體，對(duì)HeLa細(xì)胞具有明顯的增殖抑制作用，而且具時(shí)間和濃度依賴性。目前的研究結(jié)果表明，凋亡誘導(dǎo)途徑主要包括以Caspase-8激活為代表的死亡受體途徑和以Caspase-9激活為代表的線粒體途徑［24］，但有關(guān)脂轉(zhuǎn)移蛋白的抗腫瘤活性的分子機(jī)制以及抗腫瘤與轉(zhuǎn)脂功能之間的關(guān)系尚不清楚。因此，下一步我們將對(duì)PhLLTP的誘導(dǎo)凋亡機(jī)制進(jìn)行深入的研究，這將對(duì)促進(jìn)脂轉(zhuǎn)移蛋白相關(guān)的生物學(xué)功能的研究和進(jìn)一步開發(fā)利用具有重要意義。

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