冠心病痰證與載脂蛋白A5c.553G＞T基因多態(tài)性的關(guān)系研究1）

聶 婭，周小青，蘭紅勤，黎鵬程，郭春秀

冠心病發(fā)病與多種易感基因有關(guān)。痰證是冠心病臨床常見的中醫(yī)證型，但有關(guān)冠心病痰證與APOA5c.553G＞T基因多態(tài)性的相關(guān)性研究尚未見報(bào)道。

1 資料與方法

1.1 診斷標(biāo)準(zhǔn) 冠心病診斷符合1979年WHO制定的缺血性心臟病診斷標(biāo)準(zhǔn)。痰證辨證標(biāo)準(zhǔn)：參考《中華人民共和國國家標(biāo)準(zhǔn)·中醫(yī)臨床診療術(shù)語證候部分》（GB／T16751-2-1997）。非冠心病痰證主要選擇慢性支氣管炎、高血壓、高脂血癥等痰證病人。西醫(yī)診斷參照國際國內(nèi)相關(guān)疾病診斷標(biāo)準(zhǔn)。健康對(duì)照組選擇性別、年齡與冠心病組相匹配者，經(jīng)病史詢問無冠心病，體格檢查無陽性體征，心電圖、動(dòng)態(tài)心電圖或運(yùn)動(dòng)心電圖未提示心肌缺血證據(jù)，胸部X片、肝腎功能、血尿常規(guī)檢查均無異常者。

1.2 研究對(duì)象 選擇2008年6月—2010年6月在湖南中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院住院及體檢中心體檢者。256例入選對(duì)象均為湖南地區(qū)無血緣關(guān)系的漢族人群，分為4組：①冠心病痰證組58例，年齡（63.86±9.32）歲，男39例，女19例；②冠心病非痰證組51例，年齡（63.04±8.80）歲，男33例，女18例；③非冠心病痰證組73例，年齡（62.37±6.58）歲，男52例，女21例；④健康對(duì)照組74例，年齡（62.19±6.63）歲，男44例，女30例。4組年齡、性別經(jīng)分析無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），具有可比性。

1.3 研究方法

1.3.1 主要儀器和試劑 PE480型PCR儀，M-15E紫外透射儀，Palariod攝影機(jī)。TaqDNA 聚合酶、RNAse、PUC18DNA／MspI、λDNA／hindⅢ、溴乙淀（北京天根生化科技有限公司），HaeⅢ內(nèi)切酶（Fermentas）。

1.3.2 血樣采集 所有被檢者空腹12h后，于次日08：00測(cè)量身高、體重、血壓，并計(jì)算體質(zhì)量指數(shù)（BMI）。采集靜脈血5 mL，其中2mL以2%EDTANa2抗凝，用于抽提基因組DNA。其余3mL于當(dāng)日檢測(cè)血脂。

1.3.3 血脂檢測(cè) 采用酶法測(cè)定總膽固醇（TC）、三酰甘油（TG），采用化學(xué)遮蔽法直接測(cè)定高密度脂蛋白（HDL-C）、低密度脂蛋白（LDL-C）。以上檢測(cè)均在德國羅氏公司 MODULAR PP全自動(dòng)生化分析儀上進(jìn)行。

1.3.4 基因組DNA提取 采用十二烷基硫酸鈉及蛋白酶K消化，酚／氯仿提純，乙醇沉淀。

1.3.5 引物設(shè)計(jì)與合成 參考文獻(xiàn)［1］設(shè)計(jì)，正向引物5′-AGA CAC CAA GGC CCA GTT GCT GGG-3′；反向引物5′-ATG CCG CTC ACC AGG CTC TCG GCG-3′。由上海英駿生物技術(shù)公司合成。

1.3.6 PCR反應(yīng)及限制性片段長度多態(tài)性分析 PCR反應(yīng)總體系20.0μL：dd H2O 14.2μL，PCR Buffer（含 Mg2）2.0μL，dNTPs 0.5μL，正向引物、反向引物各0.5μL，DNA模板2.0 μL，DNA聚合酶0.3μL。PCR反應(yīng)條件：96℃預(yù)變5min；96℃變性30min；58℃退火30s；72℃延伸30s，循環(huán)35次；末次循環(huán)后72℃延伸7min，最后保存于4℃。取PCR產(chǎn)物10.0 μL，以HaeⅢ限制性內(nèi)切酶1.0μL，37℃水浴5h。酶切產(chǎn)物經(jīng)含EB的3%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，90V恒壓電泳1h，紫外燈下判斷結(jié)果并拍照記錄。并隨機(jī)抽取部分PCR產(chǎn)物送南京金斯特生物技術(shù)公司測(cè)序。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 使用SPSS13.0分析。計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，采用單因素方差分析、LSD、Tamhane’s法。對(duì)符合正態(tài)分布的兩獨(dú)立樣本均數(shù)間比較用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。不符合者用t’檢驗(yàn)。研究對(duì)象與Hardy-Weinberg平衡的符合程度。計(jì)數(shù)資料使用卡方檢驗(yàn)。相關(guān)基因型、危險(xiǎn)因素與CHD痰證的相關(guān)性用Logistic回歸分析。

2 結(jié) 果

2.1 研究對(duì)象臨床資料 各組在年齡、性別、吸煙史上無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，病例組與對(duì)照組具有可比性。CHD痰證組的BMI高于其他3組（P＜0.01），非CHD痰證組BMI明顯高于健康對(duì)照組（P＜0.01）；健康對(duì)照組收縮壓、舒張壓明顯低于其他3組（P＜0.01）；健康對(duì)照組TG明顯低于其他3組（P＜0.01），CHD痰證組LDL-C高于健康對(duì)照組（P＜0.01），這些數(shù)據(jù)進(jìn)一步肯定了這些危險(xiǎn)因素對(duì)CHD發(fā)病的重要影響。詳見表1。

表1 4組臨床資料比較

2.2 APOA5c.553G＞T基因型分布的Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn) 256例受檢者中，c.553G＞T位點(diǎn)GG型221例（86.33%），GT型35例（13.67%），TT型0，G等位基因頻率93.16%，T等位基因頻率6.84%，經(jīng)卡方檢驗(yàn)，本研究中APOA5c.553G＞T基因型分布頻率的實(shí)際值與預(yù)計(jì)值差異不顯著（χ2=1.378，P=0.240），符合Hardy-Weinberg平衡。說明樣本來自一個(gè)較大的、處于隨機(jī)婚配平衡狀態(tài)的群體，具有一定代表性。

2.3 4組APOA5c.553G＞T基因多態(tài)性分布 4組相比，APOA5c.553G＞T多態(tài)性基因型及等位基因分布均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。詳見表2。

表2 4組APOA5c.553G＞T基因多態(tài)性分布

2.4 APOA5c.553G＞T不同基因型的血脂水平 對(duì)全部受試者APOA5c.553G＞T位點(diǎn)不同基因型的血脂水平進(jìn)行比較，兩型間血清TG水平差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。詳見表3。

表3 全體對(duì)象c.553G＞T位點(diǎn)不同基因型間血脂水平（x±s）

2.5 APOA5c.553G＞T不同基因型與冠心病痰證發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的關(guān)系 首先根據(jù)病例-對(duì)照研究計(jì)算CHD痰證組與健康對(duì)照組間不同基因型的OR值，再將不同組別作因變量、以c.553GT、c.553GG、性別、年齡、吸煙史、舒張壓、收縮壓、BMI、血脂（TC、TG、HDL-C、LDL-C）為自變量，進(jìn)行Logistic回歸分析。結(jié)果顯示，c.553T等位基因攜帶者發(fā)生冠心病痰證的風(fēng)險(xiǎn)比野生型GG攜帶者增加了3.600倍，但在校正了年齡，性別、吸煙史、舒張壓、收縮壓、BMI、血脂等因素后，未顯示c.553GT是冠心病痰證的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。詳見表4。

表4 APOA5c.553G＞T不同基因型與冠心病痰證發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的關(guān)系

3 討 論

載脂蛋白是一類具有脂類轉(zhuǎn)運(yùn)功能的血漿蛋白質(zhì)，其結(jié)構(gòu)與合成異常將影響血脂代謝，而血脂異常是動(dòng)脈粥樣硬化和冠心病發(fā)生的重要危險(xiǎn)因素。載脂蛋白 A5是2001年［1］在ApoA1／C3／C4基因簇中發(fā)現(xiàn)并證實(shí)的一個(gè)載脂蛋白家族新成員，ApoA5基因多態(tài)性與心腦血管疾病及代謝性疾病有一定關(guān)聯(lián)性且存在種族差異［1-3］。ApoA5基因存在13個(gè)單核苷酸多態(tài)位點(diǎn)，其中ApoA5c.553G＞T是由Kao等［2］發(fā)現(xiàn)，該多態(tài)性是由于基因編碼區(qū)第553位的堿基G突變?yōu)門，使第185位甘氨酸（glycine，G）轉(zhuǎn)變?yōu)榘朊摪彼幔╟ysteine，C），進(jìn)而可能影響了蛋白功能。在本研究的256例受檢者中，c.553G＞T位點(diǎn)GG型221例（86.33%），GT型35例（13.67%），TT型0例，G等位基因頻率93.16%，T等位基因頻率6.84%，符合Hardy-Weinberg平衡。該多態(tài)位點(diǎn)的突變等位基因T的頻率相當(dāng)?shù)停ㄔ诮】等巳褐袃H為3.38%），本實(shí)驗(yàn)中未發(fā)現(xiàn)1例TT型，可能與樣本大小及樣本本身差異有關(guān)，與Kao等［2］以及其他關(guān)于中國人群的報(bào)導(dǎo)相似［4-6］。而在白種人群中的報(bào)導(dǎo)結(jié)果T等位基因的頻率尚缺如［7］，因此該多態(tài)位點(diǎn)的分布亦有明顯的種族差異。

ApoA5c.553G＞T多態(tài)性與高 TG血癥有關(guān)［1，4，5］，但也有研究認(rèn)為，除了與高TG血癥有關(guān)外，還與LDL-C升高或HDLC降低有關(guān)［4，6］。而本研究表明，c.553TG型血清TG水平明顯高于GG型（P＜0.01），而血清TC、LDL-C和HDL-C水平則沒有顯著差異。

本研究結(jié)果表明，冠心病痰證組與健康對(duì)照組相比，ApoA5c.553G＞T在基因型和等位基因頻率分布兩方面均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。c.553T等位基因攜帶者發(fā)生冠心病痰證的風(fēng)險(xiǎn)比野生型GG攜帶者分別增加了3.600倍，但在校正了年齡，性別、吸煙史、舒張壓、收縮壓、體質(zhì)量指數(shù)、血脂等因素后，未顯示c.553GT是冠心病痰證的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，這一結(jié)果可能與樣本量有限以及c.553T等位基因本身分布頻率太低有關(guān)，因此，ApoA5c.553G＞T基因變異作為冠心病痰證的獨(dú)立危險(xiǎn)因素尚需更大樣本人群研究證實(shí)。

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