急性髓細胞白血病PRDX2基因表達及其甲基化研究

燕瑋，胡文旭，楊威

（中國醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院血液病治療中心，沈陽 1 1 0 0 0 4）

Expression and Methylation Study ofPRDX2Gene in Acute Myeloid Leukemia

抑癌基因的失活機制有突變、缺失及表觀遺傳［1］。一些抑癌基因突變、缺失發(fā)生率低，而基因啟動子區(qū)胞嘧啶-磷酸 -鳥苷（c y t o s i n e p h o s p h a t e g u a n o s i n e，C p G）島中的甲基化修飾引起人們極大的興趣。越來越多的證據(jù)顯示D N A甲基化是一個早期的分子事件，有可能加速腫瘤的發(fā)展［2］。

過氧化氧化還原蛋白2（p e r o x i r e d o x i n 2，P R D X 2）作為一種抗氧化蛋白，通過清除活性氧（r e a c t i v e o x y g e ns p e c i e s，R O S）保護D N A、脂質(zhì)、蛋白免受氧化應(yīng)激損傷，調(diào)節(jié)信號傳導(dǎo)通路，預(yù)防、抑制腫瘤發(fā)生。但有關(guān)該基因在急性髓細胞白血病（a c u t e m y e l o g e n o u s l e u k e m i a，A M L）患者中的表達情況國內(nèi)報道尚少。本研究采用實時熒光定量P C R（r e a l-t i m e P C R）及甲基化特異性聚合酶鏈反應(yīng)（M S P方法），探討P R D X 2基因表達及P R D X 2基因啟動子區(qū)甲基化狀態(tài)與基因表達缺失之間的關(guān)系，為A M L的早期診斷、預(yù)后評估及治療開辟新的道路。

1 材料與方法

1.1 標本采集

收集2 0 1 0年6月至2 0 1 1年6月中國醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院血液科住院患者9 5例，分為A M L組和對照組。A M L組5 5例，男3 1例，女2 4例，中位年齡3 2（1 7~7 8）歲，白血病的診斷均經(jīng)臨床、血常規(guī)檢查、骨髓象及組織化學(xué)染色、免疫分型、染色體檢查確診，符合白血病形態(tài)學(xué)、免疫學(xué)、細胞遺傳學(xué)（M I C）分型。其中M 1 4例，M 2 1 4例，M 3 2 1例，M 4 1 0例，M 5 6例。對照組4 0例，為同期就診非白血?。ㄟ^敏性紫癜、巨幼細胞貧血）患者，男1 6例，女2 4例，中位年齡3 6（1 9~6 2）歲。

1.2 主要試劑及儀器

2×T a q聚合酶鏈反應(yīng)（P C R）M a s t e r M i x（上海T i a n g e n公司）、S Y B RG r e e n實時定量試劑盒（美國A B I公司）、D N A甲基化試劑盒E ZD N AM e t h y l a t i o n-G o l d K i tTM（美國Z y m o R e s e a r c h公司）、A B I P R I S M7 0 0 0 H T熒光定量P C R儀（美國A B I公司）；紫外分光光度儀（日本島津U V-1 6 0 1）。

1.3 骨髓單個核細胞（m o n o n u c l e a r c e l l，M N C）分離 A M L組與對照組均取肝素抗凝新鮮骨髓5 m L，經(jīng)等量P B S稀釋混勻后，緩慢加入5 m L淋巴細胞分離液中，置于自動平衡離心機中，以3 0 0 0 r/m i n離心2 0 m i n，吸取界面層M N C，P B S洗滌2次，所得M N C用于提取總R N A和總蛋白。

1.4 R e a l-t i m e R T-P C R檢測P R D X 2m R N A的表達

按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明將已提取的R N A反轉(zhuǎn)錄成互補D N A（c D N A）。進行熒光定量P C R擴增，引物序列見表1?？偡磻?yīng)體系為 2 0 μ L：c D N A模板 1 μ L，上下游引物各 0.5 μ L，S Y B RG R E E NM a s t e r-m i x 1 0 μ L，用 d d H2O補至 2 0 μ L。反應(yīng)條件為：9 5℃預(yù)變性1 0 m i n后，9 5℃變性1 0 s，6 0℃退火2 0 s，7 2℃延伸3 0 s，共4 0個循環(huán)，最后7 2℃再延伸5 m i n。由P C R曲線得到到達閾值時的循環(huán)數(shù)（c y c l e t h r e s h o l d，C t）值，以G A P D H為內(nèi)參，采用2-△△Ct方法進行相對定量分析。

1.5 甲基化特異性P C R（M S P）

應(yīng)用M e t h P r i m e r軟件設(shè)計引物，見表2。D N A甲基化修飾參考文獻［3］，對修飾后的樣本進行P C R擴增。P C R反應(yīng)體系為 2 0 μ L，修飾后的 D N A模板 1 μ L，上下游引物各 1 μ L，2×T a q P C RM a s t e r-m i x 1 0 μ L，用 d d H2O補至 2 0 μ L。反應(yīng)條件為：9 5℃預(yù)變性1 0 m i n后，9 5℃變性1 0 s，6 0℃退火2 0 s，7 2℃延伸3 0 s，共3 0個循環(huán)，最后7 2℃再延伸1 0 m i n。擴增后產(chǎn)物經(jīng)含有溴化乙錠1.5%瓊脂糖凝膠電泳，電泳結(jié)果經(jīng)凝膠成像分析儀進行分析。

1.6 統(tǒng)計學(xué)分析

計量資料用x±s表示，應(yīng)用S P S S 1 7.0軟件分析，各組間P R D X 2m R N A表達結(jié)果采用單因素方差分析，率的比較采用χ2檢驗（F i s h e r精確概率法）。P<0.0 5認為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

表1 R e a l-t i me P C R引物序列

表2 MS P引物序列

2 結(jié)果

2.1P R D X 2基因啟動子甲基化分析

對照組患者均無P R D X 2基因甲基化，A M L組患者1 7例（3 1.0%）骨髓細胞中出現(xiàn)P R D X 2基因表達甲基化，2組甲基化表達率差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=1 5.0 6，P<0.0 5），見圖1。P R D X 2基因甲基化與患者年齡、性別、分型等臨床特征無關(guān)，與診斷分期有關(guān)（P<0.0 5，表 3）。

2.2P R D X 2基因的m R N A表達

運用2-△△Ct法計算得出A M L組P R D X 2m R N A表達量明顯下降，為 3.5 6±1.5 7，與對照組（5.9 9±1.6 9）比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=-7.2 2，P<0.0 5）。同時，A M L甲基化患者骨髓中P R D X 2m R N A表達量為2.2 0±1.1 8，非甲基化患者骨髓中P R D X 2m R N A表達量為4.1 7±1.3 2，2者差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=-5.2 5，P<0.0 5）。

3 討論

P R D X 2作為一種抗氧化蛋白，最早是作為一種能增強自然殺傷細胞活性的因子而被發(fā)現(xiàn)的［4］。近年來研究證實P R D X 2可參與調(diào)節(jié)信號傳導(dǎo)通路等過程，預(yù)防、抑制腫瘤發(fā)生。H o l e等［5］證實這種新的抑癌基因在黑色素瘤、膀胱癌等多種腫瘤中表達缺失，其表達缺失與啟動子甲基化有關(guān)。P R D X 2表達缺失后加重氧化應(yīng)激的產(chǎn)生，升高細胞內(nèi)p H，破壞細胞染色質(zhì)，導(dǎo)致腫瘤發(fā)生。同時還導(dǎo)致調(diào)節(jié)蛋白激酶的活性下降，將無法有效阻斷促腫瘤因子介導(dǎo)的多條細胞信號傳導(dǎo)通路，如P D G F途徑、M A P K/J N K途徑等，從而失去抑制細胞生長、轉(zhuǎn)化、遷移，促進細胞凋亡的負調(diào)控作用，最終導(dǎo)致與腫瘤發(fā)生、發(fā)展相關(guān)的一系列生物學(xué)行為改變［6~9］。

表3P R D X 2基因甲基化與A ML患者臨床特征的關(guān)系

D N A甲基化能引起染色質(zhì)結(jié)構(gòu)、D N A構(gòu)象、D N A穩(wěn)定性及D N A與蛋白質(zhì)相互作用方式的改變，從而調(diào)控基因的表達，是表觀遺傳學(xué)重要的修飾方式［10］。F u r u t a等［11］最近研究表明在黑色素瘤細胞中P R D X 2表達下降，并與其啟動子區(qū)甲基化關(guān)系密切。A g r a w a l-S i n g h等［12］實驗結(jié)果中1 8%的A M L患者表達P R D X 2啟動子區(qū)甲基化，并證明其與P R D X 2基因表達的缺失有明顯關(guān)系。本實驗發(fā)現(xiàn)5 5例A M L患者中1 7例（3 1%）骨髓細胞存在甲基化，同時也都存在P R D X 2m R N A表達下調(diào)，在不同分期患者中甲基化的發(fā)生率有著明顯差異，完全緩解期的患者要明顯低于初診及難治復(fù)發(fā)的患者，與國外研究結(jié)果相符［12］，因此我們推測P R D X 2基因甲基化模式的改變在A M L的發(fā)生及發(fā)展中可能起著非常重要的作用。本研究在對照組患者中未發(fā)現(xiàn)P R D X 2基因啟動子區(qū)甲基化，但P R D X 2m R N A表達水平仍下降，表明P R D X 2基因啟動子甲基化并不是使基因表達改變的唯一原因，同時還可能存在基因突變、雜合性缺失等機制引起該基因表達下調(diào)或缺失，還有可能是由于在本實驗檢測的啟動子區(qū)域以外的其他C p G島也存在甲基化現(xiàn)象，同樣引起該基因表達下調(diào)或缺失。

綜上所述，本研究結(jié)果初步證實P R D X 2作為一種新興的抑癌基因在A M L的發(fā)生、發(fā)展過程中起著重要作用，而且其啟動子的甲基化在A M L中廣泛存在。而P R D X 2啟動子的甲基化后是否再次表達，以及與患者的預(yù)后關(guān)系如何仍需進一步研究。

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