GPR40反義RNA對胰島β細胞內(nèi)Ca2+濃度及胰島素分泌的影響

周一軍，李璦，宋雨凌，李妍，周慧

（中國醫(yī)科大學附屬第四醫(yī)院內(nèi)分泌科，沈陽 1 1 0 0 3 2）

2型糖尿病患者由于肥胖、脂代謝紊亂常存在血漿游離脂肪酸（free fatty acid，F(xiàn)FA）水平增高［1］，長期的FFA水平升高可導致胰島素分泌障礙，是形成胰島素抵抗、胰島β細胞功能減退的重要環(huán)節(jié)［2］。研究顯示，GTP結合蛋白耦聯(lián)受體40（GTP-binding protein coupling receptor 40，GPR40）是中長鏈 FFA的特異性受體，主要在胰島β細胞和胰島素分泌細胞系大量表達，介導了FFA對β細胞的多種作用。GPR40是1個7次跨膜受體，它是G蛋白耦聯(lián)受體家族成員之一。GPR40以前從1個人類基因組片段中發(fā)現(xiàn)，曾被認為是1種“孤兒”受體（1種未知配體的受體），不發(fā)揮生理功能。最近研究發(fā)現(xiàn)，GPR40通過介導β細胞Ca2+信號反應參與了FFA刺激的胰島素分泌。FFA作為胞外配體，通過激活胰島β細胞的GPR40增加葡萄糖刺激的胰島素分泌［3~5］。

長期暴露在高水平FFA下，胰島細胞長期大量分泌胰島素而出現(xiàn)功能障礙，引起“脂毒性”作用，去除胰島β細胞中的GPR40可以保護大鼠不患肥胖誘發(fā)的糖尿病。因此，如果能選擇性地抑制胰島β細胞膜上的GPR40受體表達，抑制其信號轉導功能，則可以防止“脂毒性”作用的發(fā)生，進而大大降低糖尿病發(fā)生的可能性。本研究擬應用反義RNA技術特異性下調(diào)胰島β細胞GPR40的表達，觀察其對胰島 β 細胞內(nèi) Ca2+濃度（［Ca2+］i）及胰島素分泌的影響。

1 材料與方法

1.1 試劑及儀器

成年SD大鼠，8~10周齡，體質(zhì)量250~300 g，由中國醫(yī)科大學實驗動物中心提供。GPR40反義RNA真核表達載體 pcDNA3.1（＋）-GPR40（－）質(zhì)粒由美國UniversityofTennesseeZhao博士惠贈；LipofectamineTM2000脂質(zhì)體轉染試劑，熒光染料探針Fura-2/AM購自Invitrogene公司；膠原酶Ⅴ、軟脂酸、油酸均為美國Sigma公司產(chǎn)品；RPMI-1640購自Gibco公司，胎牛血清為Hyclone公司產(chǎn)品，GPR40抗體購自Santa Cruz公司；胰島素放免檢測試劑盒購自中國原子能科學院；RF-5000型雙波長熒光分光光度計為日本島津制造。1.2 方法

1.2.1 胰島β細胞的分離純化：成年SD大鼠，腹腔麻醉，剖腹，絲線接扎膽總管入十二指腸處，膽總管內(nèi)插管，逆行灌注0.5 g/L膠原酶Ⅴ10 mL，分離胰腺，38℃水浴振蕩10 min取出，冰浴中撕碎，繼續(xù)38℃水浴振蕩10 min后，D-Hanks液終止消化，重復1~2次，直到組織完全消化。500 μm篩網(wǎng)過濾消化液，D-Hanks液離心洗滌3遍，沉淀物制成懸液。離心管中，依次加入 250、200、110 g/L Ficoll分離液和胰島懸液，3 000 r/min離心20 min，分層，吸出各界面細胞，D-Hanks液離心洗滌3遍，置入含胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液中，37℃、CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。

1.2.2 GPR40反義RNA表達質(zhì)粒轉染胰島細胞：將胰島細胞以2×105/孔接種于24孔培養(yǎng)板上，按照脂質(zhì)體介導法，取1 μg純化的重組反義RNA表達質(zhì)粒 pcDNA3.1（＋）-GPR40（－），稀釋于 50 μL 無血清培養(yǎng)液中；加入2.5 μL LipofectamineTM2000脂質(zhì)體至50 μL無血清培養(yǎng)液中，室溫靜置20~30 min；將質(zhì)粒DNA與脂質(zhì)體的復合體按100 μL/孔加到24孔培養(yǎng)板中之后加入0.5 mL不含血清的培養(yǎng)液，輕輕搖動混勻，置入培養(yǎng)箱培養(yǎng)4 h后，移去轉染復合物，加入無血清培養(yǎng)液孵育48 h；同時設置空白質(zhì)粒轉染組和對照組，每組設6個復孔。

1.2.3 免疫熒光染色：將各組胰島細胞培養(yǎng)于蓋玻片上，37℃下生長36 h后，加入4%多聚甲醛，室溫下固定10 min，加入GPR40單克隆抗體，4℃孵育過夜，用TBS及TBST漂洗后3次，相應的二抗室溫下孵育1 h，二抗被相應的帶有Alexa F1uor 488546熒光所標記。用倒置熒光顯微鏡觀察，未加一抗的陰性對照沒有顯示陽性染色。

1.2.4 Western blot檢測GPR40表達：收集各組細胞，RIPA裂解液裂解細胞，離心收集上清。提取細胞總蛋白后，BSA法蛋白定量，10%SDS-PAGE電泳分離，轉膜，室溫下5%脫脂奶粉、TBST封閉液封閉1 h，加入特異性GPR40抗體，4℃孵育過夜，TBST洗膜3次，二抗37℃孵育1 h，洗膜3次，ECL顯色系統(tǒng)顯示蛋白條帶，曝光、顯影。用UVP凝膠影象分析儀測定蛋白條帶濃度。

1.2.5 胰島素測定：各組胰島細胞培養(yǎng)48 h后，換用含軟脂酸和油酸混合物（軟脂酸∶油酸=2∶1，終濃度為1.0 mmol/L）的RPMI 1640培養(yǎng)液，分別作用胰島細胞10、30、60 min后，置于濃度為 16.7 mmol/L的高葡萄糖培養(yǎng)液中，37℃、50 mL/L CO2培養(yǎng)箱孵育2 h，收集培養(yǎng)液，放射免疫法測定胰島素水平。

1.2.6 測定［Ca2+］i：參照文獻［6］的方法，將上述細胞懸液在37℃預溫5 min后，加入Fura-2/AM（終濃度為5 μmol/L）37℃恒溫振蕩45 min。負載后的細胞以含0.2%牛血清白蛋白的溫Hank液洗滌2次，最后調(diào)整細胞數(shù)為2×106/mL，測前細胞先于37℃復溫2 min，采用熒光分光光度計測定熒光，測試參數(shù)如下：激發(fā)波長340 nm，裂隙寬度3 nm；發(fā)射波長500 nm，裂隙寬度 10 nm。用下面的公式：［Ca2+］i=Kd［（F-Fmin）/（Fmax-F）］（nmol/L）來計算［Ca2+］i濃度。Kd為解離常數(shù)（225 nmol/L），F(xiàn)為測得的熒光強度，F(xiàn)max為加入1%Triton X-100后，測得的最大熒光強度，F(xiàn)min為加入EGTA（10 mmol/L）后測得的最小熒光強度。

1.3 統(tǒng)計學處理

實驗結果均以x±s表示，使用SPSS 11.5統(tǒng)計軟件，多組樣本均數(shù)間比較用方差分析，組間兩兩比較采用Dunnettt檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 免疫熒光染色結果

對照組和空白質(zhì)粒轉染組胰島β細胞，在熒光顯微鏡下觀察，細胞膜呈現(xiàn)綠色熒光，胰島β細胞轉染質(zhì)粒 pcDNA3.1（＋）-GPR40（－）后，綠色熒光明顯減弱（圖1）。

2.2 GPR40反義RNA體外有效抑制胰島細胞GPR40蛋白表達

Western blot結果顯示，反義RNA轉染組胰島細胞中GPR40蛋白的表達水平顯著低于對照組和空白質(zhì)粒轉染組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），而對照組和空白質(zhì)粒轉染組GPR40蛋白表達差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05，圖2），結果顯示反義RNA轉染能夠有效地下調(diào)胰島細胞中GPR40的表達。

2.3 GPR40反義RNA對胰島β細胞［Ca2+］i的影響

當加入軟脂酸和油酸混合物時，引起對照組胰島細胞［Ca2+］i升高分2個時相：即起始的短暫快速相和隨后的持續(xù)相，快速相［Ca2+］i升高呈時間依賴性；同樣軟脂酸和油酸混合物升高空白質(zhì)粒轉染組細胞［Ca2+］i；而軟脂酸和油酸混合物對反義RNA轉染組細胞［Ca2+］i升高不顯著，在各作用時間點，反義RNA轉染組細胞［Ca2+］i顯著低于對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05，表 1）。

2.4 GPR40反義RNA對胰島β細胞胰島素分泌的影響

軟脂酸和油酸混合物作用對照組胰島細胞后，隨作用時間增長，胰島素分泌水平明顯增加（P＜0.05），呈時間依賴性；軟脂酸和油酸混合物同樣升高空白質(zhì)粒轉染組胰島素分泌水平，反義RNA轉染組胰島素分泌較其它組受到顯著抑制，在各作用時間點，反義RNA轉染組胰島素水平顯著低于對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05，表2）。

3 討論

FFA短期作用能調(diào)節(jié)基礎胰島素分泌和葡萄糖刺激的胰島素分泌（glucose stimulated insulin secre－tion，GSIS）。長期FFA水平升高可導致胰島素分泌障礙，甚至胰島β細胞凋亡，即脂毒性作用，這是形成胰島素抵抗、胰島β細胞功能減退的重要環(huán)節(jié)，直接參與糖尿病的發(fā)生發(fā)展。

表1 G P R 4 0反義R N A對胰島β細胞內(nèi)C a2+濃度的影響（n mo l/L，x±s）T a b.1 E f f e c t o f G P R 4 0 a n t i-s e n s e R N Ao n t h e［C a2+］i i n β-c e l l s（n mo l/L，x±s）

中長鏈FFA增強胰腺β細胞中由葡萄糖刺激產(chǎn)生的胰島素分泌作用與GPR40的活化有關，已知中長鏈FFA是GPR40的內(nèi)源性配體，一般認為有活性的是含有10~16個碳原子的飽和脂肪酸以及含有18~22個碳原子的不飽和脂肪酸。GPR40在胰腺中大量表達，它作為跨膜受體，可以接受細胞外FFA的刺激，通過信息轉導機制，使得細胞外鈣離子內(nèi)流，放大GSIS［7~9］。本研究顯示，在高濃度葡萄糖和Ca2+存在的環(huán)境下，軟脂酸和油酸混合物可刺激大鼠胰島細胞膜上的GPR40，導致細胞內(nèi)［Ca2+］i顯著升高，放大GSIS。FFA作為GPR40的內(nèi)源性配體，通過一種全新的作用機制放大胰島素的分泌。

表2 G P R 4 0反義R N A對胰島β細胞胰島素分泌的影響（mmo l/L，x±s）T a b.2 E f f e c t o f G P R 4 0 a n t i-s e n s e R N Ao n i n s u l i n s e c r e t i o n i n β-c e l l s（mmo l/L，x±s）

反義RNA技術是近年發(fā)展起來的新型分子生物學技術，它是利用基因重組，構建人工表達載體，使其表達反義RNA，通過堿基互補與靶RNA配對結合，特異性封閉基因的手段［10］，在抑制有害基因表達或失控基因的過度表達中顯示了良好的應用前景。本研究采用反義RNA技術，結果表明GPR40反義RNA轉染能夠有效地下調(diào)胰島細胞中GPR40的表達，并且經(jīng)過進一步研究發(fā)現(xiàn)，下調(diào)GPR40的表達可以顯著抑制細胞內(nèi)［Ca2+］i升高，同時GPR40反義RNA降低葡萄糖刺激胰島素分泌水平。去除細胞膜上的GPR40，細胞內(nèi)［Ca2+］i和胰島素分泌水平將會大大降低，說明軟脂酸和油酸混合物刺激放大的GSIS很大一部分經(jīng)由GPR40實現(xiàn)信息轉導。另外有實驗表明，GPR40－/－小鼠能免于肥胖介導的高胰島素血癥、肝脂肪變和糖耐量減退，小鼠胰島β細胞過度表達GPR40會損害β細胞功能［11］。研究結果表明，對于一些肥胖癥患者，體內(nèi)的高水平的FFA可能會引發(fā)糖尿病的發(fā)生，如果能找到一種高效的GPR40抑制劑，有選擇性地和胰島β細胞膜上的GPR40受體結合，抑制其信息轉導的功能，則可以保護部分患者免受“脂毒性”作用，進而大大降低糖尿病發(fā)生的可能性。因此，研究GPR40的高效低毒的小分子拮抗劑，阻斷GPR40的分子有可能用于新型抗糖尿病藥物的開發(fā)，對于防治糖尿病具有非常重要的意義。

綜上所述，F(xiàn)FA能夠通過激活胰島β細胞的GPR40增加GSIS，用GPR40反義RNA下調(diào)β細胞GPR40的表達，導致FFA介導的細胞內(nèi)Ca2+應答及胰島素分泌的顯著抑制，提示GPR40通過介導β細胞Ca2+信號反應參與了FFA刺激的胰島素分泌。

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