高糖和脂多糖對(duì)腹膜間皮細(xì)胞中骨橋蛋白的表達(dá)及其所致纖維化的影響

霍愛晶，馬健飛，李程程，鄧文艷，王力寧

（中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院腎內(nèi)科，沈陽 1 1 0 0 0 1）

腹膜纖維化已成為多數(shù)慢性腎衰患者退出腹膜透析的一個(gè)主要因素。腹膜間皮細(xì)胞（peritoneal mesothelial cell，PMC）在腹膜纖維化中起關(guān)鍵作用。當(dāng)暴露在透析相關(guān)性腹膜炎環(huán)境下時(shí)，PMC的形態(tài)、結(jié)構(gòu)及功能發(fā)生變化，導(dǎo)致其最終進(jìn)入不可逆性腹膜纖維化階段。本研究通過觀察高糖透析液及炎性因子脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）單獨(dú)及聯(lián)合作用下骨橋蛋白（osteopontin，OPN）及纖維化因子轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子 β1（transforming growth factor β1，TGF-β1）表達(dá)的變化，進(jìn)一步揭示腹膜纖維化的發(fā)生及阻斷機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：健康雄性SD大鼠，體質(zhì)量160~200 g，普通級(jí)，由中國醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1.1.2 主要試劑：DMEM/F12干粉培養(yǎng)基、胎牛血清（天津?yàn)枺?；LPS粉劑（美國Sigma公司）；0.25%胰酶（沈陽博爾美公司）；Trizol試劑（美國Invitrogen公司）；OPN多克隆抗體、DAB顯色液、SABC試劑盒（武漢博士德公司）；Real-time RT-PCR試劑盒（大連TaKaRa公司）；PCR引物由北京華大基因公司合成。

1.2 方法

1.2.1 大鼠PMC（RPMC）的培養(yǎng)、傳代與鑒定：具體方法參照文獻(xiàn)［1］。

1.2.2 免疫組織化學(xué)法檢測(cè)OPN的表達(dá)：采用24孔板培養(yǎng)細(xì)胞無菌爬片24 h后，無血清同步化12 h，分組并作用 24 h：（1）正常對(duì)照組：培養(yǎng)基中葡萄糖濃度 0.1%；（2）2.5%高糖組；（3）LPS（50 μmol/L）組；（4）2.5%高糖+LPS（50 μmol/L）聯(lián)合作用組。4%多聚甲醛固定，0.5%Trix X-100打孔，3%H2O2甲醇室溫孵育，滅活內(nèi)源性過氧化物酶，血清封閉孵育，分別滴加1︰150稀釋的OPN一抗試劑，4℃過夜（PBS代替一抗做陰性對(duì)照），滴加羊抗兔IgG孵育，DAB顯色。OPN以胞質(zhì)及胞核染色為陽性，選取不同視野（×100）計(jì)算單位面積陽性染色區(qū)域平均積分光密度（A）。計(jì)數(shù)OPN染色陽性細(xì)胞數(shù)占1個(gè)視野總細(xì)胞數(shù)的百分比。比較各組均值。

1.2.3 Real-time RT-PCR 檢測(cè) OPN、TGF-β1mRNA表達(dá)：實(shí)驗(yàn)分組如下：（1）正常對(duì)照組：只加1%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基作用24 h；（2）LPS組：a亞組：不同濃度 LPS（1，50，100 μg/mL）分別作用 24 h；b亞組：50 μg/mL LPS分別作用不同時(shí)間（8，12，24，34，48h）；（3）高糖組：a亞組：不同濃度高糖（1.5%，2.5%，4.25%）分別作用24 h；b亞組：2.5%高糖作用不同時(shí)間（8，12，24，34，48 h）。Trizol提取細(xì)胞總RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。PCR反應(yīng)條件為：95℃30 s，60 ℃ 34 s，60 ℃ 60 s，共 42 個(gè)循環(huán)。OPN 引物序列：上游：5′GCAGGACTGAAGGAGC3′；下游：5′GAGACAGGAGGCAAGG3′（145 bp）；TGF-β1 引物序列：上游：5′GGTGGACCGCAACAACG3′；下游：5′TGAGCACTGAAGCGAAAGC3′（327 bp）；β-actin 引物序列：上游：5′CGTGCGTGACATTAAAGAG3′；下游：5′TTGCCGATAGTGATGACCT 3′（132 bp）。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。計(jì)量資料用x±s表示，組間比較采用單因素方差分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 RPMC的培養(yǎng)和鑒定

培養(yǎng)的RPMC呈多邊形、菱形、橢圓形，大小不等。細(xì)胞融合后，呈典型的鋪路石或鵝卵石樣外觀。傳代后用抗大鼠keratin和抗Ⅷ因子抗體檢測(cè)相關(guān)抗原，結(jié)果顯示：抗大鼠keratin陽性（圖1），抗Ⅷ因子相關(guān)抗原陰性（圖2）。

2.2 細(xì)胞免疫組化結(jié)果

2.2.1 OPN蛋白的表達(dá)：正常組細(xì)胞形態(tài)呈多邊形外觀，細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)狀態(tài)良好；LPS組及高糖組細(xì)胞形態(tài)逐漸由多邊形、鋪路石樣外觀向梭形轉(zhuǎn)變，細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)欠佳，細(xì)胞貼壁減少。高糖及LPS聯(lián)合作用組細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)較前更差，貼壁細(xì)胞減少。OPN在正常對(duì)照組細(xì)胞質(zhì)中可見少量表達(dá)，在高糖或LPS單獨(dú)及聯(lián)合作用組細(xì)胞胞質(zhì)中的表達(dá)則逐漸增強(qiáng)，3組積分光密度均值（高糖組：6.420 0±0.565 6，LPS組：8.416 7±1.758 9，高糖+LPS聯(lián)合作用組：20.430 0±1.630 0）與正常組（0.986 7±0.227 0）比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）；高糖與LPS單獨(dú)作用組間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>0.05）；2者聯(lián)合作用組與高糖或LPS單獨(dú)作用組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。

2.3 Real-time RT-PCR結(jié)果

2.3.1 高糖或LPS單獨(dú)作用下OPNmRNA表達(dá)：（1）不同作用時(shí)間：高糖或50 μg/mL LPS單獨(dú)作用8~48 h組RPMC中OPNmRNA表達(dá)顯著增加，組間比較或與0h組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01，P<0.05），見圖 2。（2）不同作用濃度：1.5%，2.5%，4.25%高糖作用24 h，RPMC中OPNmRNA表達(dá)量顯著增高，呈劑量依賴性，組間比較或與正常對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05，P<0.01）。0，10，50，100 μg/mL LPS 作用 24 h，RPMC 中 OPNmRNA表達(dá)量較正常對(duì)照組顯著增高，呈劑量依賴性，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；10 μg/mL LPS組與 50 μg/mL LPS 組間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，50 μg/mL LPS 組與100 μg/mL LPS組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。見圖3。

2.3.2 高糖及LPS聯(lián)合作用：高糖+LPS聯(lián)合作用組RPMC 中，OPN、TGF-β1mRNA 表達(dá)較高糖或 LPS單獨(dú)作用組顯著增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），單獨(dú)作用組間比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。見圖4。

3 討論

腹膜透析是終末期腎衰患者主要替代治療之一。目前應(yīng)用于臨床的透析液均為非生理適受濃度的高糖腹透液，加之透析過程中常合并革蘭陰性桿菌性腹膜炎，導(dǎo)致腹膜功能不良，加速了腹膜纖維化過程，使患者最終退出治療，限制了腹膜透析在臨床中的應(yīng)用［2，3］。LPS 是革蘭陰性桿菌的主要成分，PMC作為腹膜的主要構(gòu)成細(xì)胞，在炎癥導(dǎo)致的腹膜纖維化過程中起關(guān)鍵作用，研究LPS對(duì)PMC的影響是闡明透析致纖維化的病理生理機(jī)制中的重要部分。OPN是一種帶負(fù)電的分泌性磷酸化糖蛋白，由成骨細(xì)胞、破骨細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、T細(xì)胞、血管平滑肌細(xì)胞、成纖維細(xì)胞等細(xì)胞分泌，與細(xì)胞表面多種整合素受體或CD44異構(gòu)體結(jié)合，介導(dǎo)細(xì)胞—細(xì)胞、細(xì)胞—基質(zhì)的相互作用，與炎性細(xì)胞浸潤及實(shí)體組織纖維化等病理過程有關(guān)［4~6］。

本研究通過觀察高糖及LPS作用下RPMC中OPN表達(dá)的時(shí)間關(guān)系和量效曲線，發(fā)現(xiàn)在高糖、LPS的作用下，RPMC細(xì)胞質(zhì)中OPN表達(dá)顯著增加，同時(shí)，RPMC的形態(tài)逐漸由鋪路石狀向長(zhǎng)梭形轉(zhuǎn)變。目前，已證實(shí)MAPK超家族等多條信號(hào)通路參與了OPN的調(diào)控過程，我們推斷LPS可能是通過上調(diào)IL-1β在細(xì)胞中的表達(dá)，高糖則通過激活MAPK、NF-κB等通路，使OPN表達(dá)增強(qiáng)，從而啟動(dòng)下游纖維化過程。

在細(xì)胞纖維化變性過程中，TGF-β1的激活被認(rèn)為是病程進(jìn)展的標(biāo)志點(diǎn)。本研究結(jié)果顯示：在高糖、LPS作用下，TGF-β1呈上調(diào)趨勢(shì)。既往研究發(fā)現(xiàn)，OPN大量表達(dá)促進(jìn)了巨噬細(xì)胞的趨化聚集，而活化的巨噬細(xì)胞通過產(chǎn)生TGF-β、血小板源性生長(zhǎng)因子、IL-1、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子等促進(jìn)成纖維細(xì)胞增殖活化，從而導(dǎo)致細(xì)胞間質(zhì)纖維化［7］。文獻(xiàn)報(bào)道，TGF-β1下游信號(hào)蛋白Smad3與OPN基因啟動(dòng)子結(jié)合，Smad4與阻遏蛋白結(jié)合并使之移位，從而促使OPN mRNA轉(zhuǎn)錄，OPN可能是TGF-β的下游分子，參與TGF 介導(dǎo)的病變［6］。

綜上所述，OPN是腹透相關(guān)性纖維化進(jìn)程中重要的參與者，腹透相關(guān)性腹膜炎過程中高糖及LPS可能通過同一通路疊加作用，加速細(xì)胞基質(zhì)纖維化過程。OPN與TGF-β1形成網(wǎng)絡(luò)，互相促進(jìn)，加速了纖維化進(jìn)程。因此，阻斷OPN在腹膜的表達(dá)可能對(duì)腹膜纖維化具有潛在的治療價(jià)值。

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