海島棉D(zhuǎn)ELLA蛋白基因GbGAI2的克隆及其在胚珠中表達(dá)分析

詹杰鵬，崔百明，彭明，曲廷云，鄭銀英

（1石河子大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院／農(nóng)業(yè)生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，石河子832003；2中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶生物技術(shù)研究所，?？?71101）

棉花作為棉紡織業(yè)的原材料，與人們的日常生活密切相關(guān)，是一種全球性的重要經(jīng)濟(jì)作物，也是我國重要的經(jīng)濟(jì)和戰(zhàn)略物資。海島棉又名長絨棉，其纖維細(xì)長，強(qiáng)力高，紡紗性能極佳，在我國僅在新疆的部分地區(qū)出產(chǎn)長絨棉，產(chǎn)量極為有限。

赤霉素（Gibberellins，GA）作為一種重要的植物激素，廣泛存在于各種植物中，在調(diào)控胚根的生長、莖桿的伸長、葉片的延展、花的發(fā)育、花器的分化和果實(shí)的成熟等階段發(fā)揮重要作用［1］。棉纖維的發(fā)育可劃分為4個不同且相互重疊的時期：纖維的起始、延伸、次生壁合成以及成熟，而纖維的起始和伸長過程影響棉纖維的產(chǎn)量。棉纖維細(xì)胞的啟動需要激素的刺激，其中赤霉素在誘導(dǎo)單纖維細(xì)胞產(chǎn)生和伸長中具有重要作用［2］

DELLA蛋白是一類 GRAS（GAI、RGA、SCR）家族蛋白［1］，作為GA信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中的一類轉(zhuǎn)錄因子，主要起負(fù)調(diào)控作用，抑制GA信號向下游傳遞。在DELLA蛋白的氨基酸序列中，N端同源性總體上不高，但存在DELLA和TVHYNP兩個非常保守的酸性結(jié)構(gòu)域［3］。序列中，N端同源性總體上不高，但存在DELLA和TVHYNP兩個非常保守的酸性結(jié)構(gòu)域［3］。Itoh等［4］利用水稻SLR1基因的突變體分析了DELLA蛋白不同保守結(jié)構(gòu)域的功能，認(rèn)為DELLA與VHYNP是GA信號感知結(jié)構(gòu)域。GA可誘導(dǎo)DELLA蛋白的降解，在水稻GA轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中，GA與質(zhì)膜外受體GID1結(jié)合，通過G蛋白或Ca2＋以及GID1將信號傳遞到胞內(nèi)，誘導(dǎo)DELLA蛋白通過泛素化蛋白酶通道降解，解除DELLA蛋白的抑制作用，進(jìn)而調(diào)節(jié)植物的生長發(fā)育［5］。DELLA蛋白結(jié)構(gòu)的完整性為正常GA反應(yīng)所必需，如果DELLA蛋白的結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，使之不能感知GA信號，DELLA蛋白便成為組成性的阻遏蛋白，植株表現(xiàn)出類似GA缺乏的表型［1］。目前，在已發(fā)現(xiàn)的DELLA突變體中，植株大多表現(xiàn)為對GA不敏感的矮化表型。研究表明這些突變體都是因?yàn)镈ELLA蛋白在DELLA區(qū)域發(fā)生了變化，不能感知GA信號，造成DELLA蛋白的積累，從而表現(xiàn)出 GA 不敏感的性狀［1，6－8］。

近些年來，有關(guān)棉花中DELLA蛋白的研究取得了很大的進(jìn)展。棉花中有4個基因編碼DELLA蛋白的同源基因，分別為 Gh GAI1、Gh GAI2、Gh－GAI3、Gh GAI4，其中已證明 Gh GAI3和Gh GAI4各有2個等位基因GhGAI3a、GhGAI3b、GhGAI4a、Gh GAI4b［9］。預(yù)測海島棉中也存在多個編碼DELLA蛋白的基因。廖文斌等［8］首次從海島棉中克隆得到1個類似DELLA蛋白基因Gh RGL，并證明其包含有DELLA蛋白所有的保守結(jié)構(gòu)域。本實(shí)驗(yàn)克隆了海島棉中DELLA蛋白同源基因GbGAI2，分析了GbGAI2在海島棉胚珠不同發(fā)育階段表達(dá)量的差異。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1材料

海島棉（Gossiypium barbadense L.）新海14由石河子大學(xué)農(nóng)學(xué)院張微教授提供。

1.1.2試劑

Taq酶、AMV、DNA回收試劑盒、DNA連接酶、p GEM－Teasy載體等均由Promega公司提供，膜結(jié)合DNA清除試劑盒由北京天恩澤基因科技有限公司提供，引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成，測序由北京六合華大基因科技股份有限公司完成。

1.2 方法

1.2.1 DNA提取

取大田中生長3個月的海島棉（新海14）植株幼葉（頂端未展開葉片及向下數(shù)的兩片展開葉）0.5～1.0 g，CTAB法提取海島棉基因組總DNA。

1.2.2基因克隆

根據(jù)已知棉花DELLA蛋白Gh GAI2（Gen－Bank登錄號：FJ974045）設(shè)計上游引物：5′－CCCGGGATGAAGCGAGACCACAATCA－3′；

下游引物：5′－GAGCTCTCACTGGCTTATGGCGGTGG－3′。

以海島棉基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR 程序：94℃5 min后，94℃30 s，66℃45 s，72℃1 min，共35個循環(huán)；72℃10 min。PCR產(chǎn)物置于1.5%瓊脂糖中電泳，回收目的片段，回收產(chǎn)物與pGEM－Teasy載體連接后轉(zhuǎn)化E.coli DH5α感受態(tài)細(xì)胞，涂于LB固體培養(yǎng)基（含50μg／m L Amp）上，37℃培養(yǎng)16 h后，挑取菌落，液體LB培養(yǎng)基（含50 μg／m L Amp）37℃震蕩培養(yǎng)12 h后，提取質(zhì)粒DNA，酶切鑒定正確質(zhì)粒DNA送上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測序。

1.2.3序列分析

利用DNAMAN軟件進(jìn)行多重序列比較和同源性分析。采用Mega 5.1軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，參數(shù)設(shè)置：采取最大簡約法（Maximun Parsimony，MP）構(gòu)建系統(tǒng)樹，隨機(jī)逐步比較的方式搜索最佳系統(tǒng)樹，對生成的系統(tǒng)發(fā)育樹進(jìn)行Bootstrap校正，最終生成系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.4胚珠采集

胚珠采自海島棉開花后第1天（1 DPA）至25天（25 DPA）的棉鈴，隔1 d采集1次，從第8 DPA開始，胚珠上已長出棉纖維，小心分離棉纖維與胚珠組織，收集胚珠。所采集到的胚珠用錫箔紙包好后迅速放入液氮罐中保存，帶回實(shí)驗(yàn)室。

1.2.5 RNA的提取和cDNA合成

利用CTAB／酸酚法［10］提取海島棉花后不同發(fā)育時期胚珠組織總RNA，用北京天恩澤基因科技有限公司提供的膜結(jié)合DNA清除試劑盒進(jìn)一步純化海島棉胚珠組織總RNA。

反轉(zhuǎn)錄采用20μL體系，利用AMV反轉(zhuǎn)錄酶逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈。20μL體系中含1μg總RNA，DEPC水6.5μL，Olig d T 181μL，75℃保溫5 min后，冰上冷卻5 min，然后再依次加入RNase Inhibitor（40 U／μL）0.5μL，5×AMV buffer 4μL，dNTPs（10 mmol／L）2μL和 AMV（5 U／μL）1μL，25℃保溫10 min，42℃溫育60 min，70℃變性5 min，冰浴5 min。所得逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物加EDTA（0.75 mol／L）稀釋至總體積為50μL，－20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.6半定量RT－PCR

以海島棉花后不同發(fā)育時期胚珠組織總RNA逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板，檢測Gb GAI2基因在海島棉不同發(fā)育時期胚珠中的表達(dá)情況。

用棉花Gh His3作為內(nèi)標(biāo)基因，Gb GAI2擴(kuò)增引物與內(nèi)標(biāo)基因擴(kuò)增引物見表1。

內(nèi)標(biāo)基因與目的基因同機(jī)分管擴(kuò)增，擴(kuò)增體系中含cDNA（20 ng／μL），10×PCR buffer 2 m L，d NTP（10 mmol／L）1μL，引物（10μmol／L）0.5μL和Taq（5 U／μL）0.2μL，dd H2O 加至總體積20 μL。擴(kuò)增條件為94℃3 min；94℃30 s，58℃45 s，72℃延伸1 min，25個循環(huán)，72℃10 min。PCR產(chǎn)物置1.5%瓊脂糖中電泳，用紫外凝膠成像儀（Bio－Rad）觀察結(jié)果。試驗(yàn)重復(fù)3次。

表1 半定量RT－PCR引物Tab.1 The primers of Semi－quantitative RT－PCR experiment

2 結(jié)果與分析

2.1 GbGAI2基因的克隆與序列分析

已報道棉花DELLA蛋白基因不含有內(nèi)含子，本研究根據(jù)已知陸地棉D(zhuǎn)ELLA蛋白GhGAI2設(shè)計特異性引物，以海島棉基因組DNA為模板，PCR成功擴(kuò)增得到1條目的片段（圖1）。

圖1 GbGAI2b基因擴(kuò)增Fig.1 Amplification of the GbGAI2 gene from Gossypium barbadense L.variety of Xinhai 14

測序發(fā)現(xiàn)該基因片段與陸地棉D(zhuǎn)ELLA蛋白基因Gh GAI2相似性最高，將其命名為GbGAI2。該基因含有1個完整的閱讀框，全長1848 bp，編碼616個氨基酸序列（圖2）。

將GbGAI2與4個雙子葉植物（陸地棉：DQ006269、FJ974045、HM034760、HM034763、HM034761和 HM034762；擬南芥：CAA72177；葡萄：AAM19210；蕃茄 AAP22369）和3個單子葉植物（水稻：BAA90749.1；小麥：CAB51555；玉米：CAB51557）的已知DELLA蛋白進(jìn)行氨基酸多重序列比較分析（圖2），發(fā)現(xiàn)GbGAI2蛋白具有GRAS家族的所有典型結(jié)構(gòu)域，包括核定位信號域NLS，DELLA蛋白N端保守結(jié)構(gòu)域DELLA和TVHYNP區(qū)域，C端保守結(jié)構(gòu)VHIID、PFYRE和SAW，以及在GA信號傳導(dǎo)過程中起重要調(diào)節(jié)作用的LZ區(qū)域和poly S／T／V 區(qū)域（圖2），由此推測GbGAI2蛋白屬于植物特有的GRAS轉(zhuǎn)錄因子的DELLA亞族，并有可能參與GA信號通路調(diào)節(jié)。

圖2 海島棉GbGAI2氨基酸序列與已知植物DELLA蛋白氨基酸序列比對Fig.2 Amino acid sequence comparison of putative GbGAI2 with other related proteins

對海島棉Gb GAI2與已知植物DELLA蛋白氨基酸序列的相似性進(jìn)行分析（表2），發(fā)現(xiàn)海島棉Gb GAI2與已知植物DELLA蛋白氨基酸序列保守區(qū)高度一致，平均相似性59.14%。其中與陸地棉D(zhuǎn)ELLA蛋白GhGAI2相似性最高，達(dá)到90.13%，其次為葡萄，相似性為69.12%。

表2 海島棉GbGAI2與已知植物DELLA蛋白相似性比較Tab.2 Identity analysis of amino acid sequence of putative GbGAI2 with other related proteins

構(gòu)建海島棉GbGAI2與已知植物DELLA蛋白氨基酸序列的系統(tǒng)發(fā)育樹（圖3），發(fā)育樹中DELLA蛋白主要包括單子葉植物和雙子葉植物。結(jié)合海島棉Gb GAI2與已知植物DELLA蛋白全長氨基酸序列的相似性比較進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)GbGAI2與陸地棉Gh GAI2蛋白氨基酸序列相似性最高，系統(tǒng)發(fā)育樹中處于最近的一個分支，此外，除陸地棉D(zhuǎn)ELLA蛋白GhGAI3a、GhGAI3b、GhGAI4a和GhGAI4b外，海島棉GbGAI2與其他雙子葉植物DELLA蛋白氨基酸序列的相似性普遍高于單子葉植物，在發(fā)育樹中處于一個分支，單子葉植物處于另一個分支。

圖3 海島棉D(zhuǎn)ELLA蛋白GbGAI2系統(tǒng)發(fā)育樹分析Fig.3 Phylogenetic analysis of GbGAI2 protein with other related proteins

2.2 不同時期海島棉胚珠中DELLA基因表達(dá)分析

棉花纖維形成和發(fā)育過程可分為纖維原始細(xì)胞分化和突起（1－2 DPA）、初生壁伸長（0－25 DPA）、次生壁增厚（20－45 DPA）及脫水成熟（45－50 DPA）4個相互重疊的時期［11］。本研究分析了DELLA蛋白基因GbGAI2在海島棉胚珠不同發(fā)育階段表達(dá)情況。由圖4可見，海島棉D(zhuǎn)ELLA蛋白基因Gb－GAI2在花后胚珠發(fā)育的各個階段均有表達(dá)，但不同階段表達(dá)量明顯不同。Gb GAI2在海島棉胚珠發(fā)育的初始階段（1－5 DPA）有高表達(dá)量，之后略有降低，自第9 DPA開始表達(dá)量又有所上升，說明DELLA蛋白GbGAI2可能在棉纖維發(fā)育的起始階段具有重要作用，并對棉花纖維的伸長起到一定作用。待胚珠生長至第23 DPA時，GbGAI2表達(dá)量達(dá)到最高，表明GbGAI2可能參與棉纖維次生壁加厚。

圖4 海島棉D(zhuǎn)ELLA蛋白基因GbGAI2 1－25DPA胚珠組織的表達(dá)模式Fig.4 The expression level of DELLA gene of Gossiypium barbadense L.in ovule in 1－25DPA

3 討論

赤霉素廣泛存在于植物界中，在植物整個生命循環(huán)過程中起著重要的調(diào)控作用［12］。DELLA蛋白在赤霉素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中起負(fù)調(diào)控作用，DELLA蛋白感知GA信號后通過泛素化通道降解，解除抑制［13］。研究表明DELLA蛋白在赤霉素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)體系中起重要作用，其在赤霉素與其他植物激素互作中的作用也得以闡明［13］。

本研究成功克隆得到了海島棉D(zhuǎn)ELLA蛋白基因GbGAI2，而且Gb GAI2基因所編碼的氨基酸序列與已知其他物種DELLA蛋白氨基酸序列在保守區(qū)具有很高的一致性，具有GRAS家族蛋白的所有特征結(jié)構(gòu)域，表明GbGAI2編碼的蛋白產(chǎn)物屬于DELLA蛋白家族的一種，很有可能參與海島棉的GA信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。

比較Gb GAI2與已知DELLA蛋白氨基酸序列的相似性，并結(jié)合DELLA蛋白系統(tǒng)發(fā)育樹進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)海島棉GbGAI2蛋白與陸地棉D(zhuǎn)ELLA蛋白GhGAI2氨基酸序列相似性最高。除陸地棉Gh－GAI3s、Gh GAI4s外，Gb GAI2與雙子葉植物DELLA蛋白間的相似性普遍高于單子葉植物。Gb－GAI2與陸地棉Gh GAI3a、Gh GAI3b、Gh GAI4a和GhGAI4b間氨基酸序列相似性較低。已有研究結(jié)果表明Gh GAI1與擬南芥5個DELLA蛋白的氨基酸序列相似性為58～64%［8］，而 GhGAI3a、Gh－GAI3b、Gh GAI4a和Gh GAI4b與其他物種中DELLA蛋白的相似性為38～40%，具有較大的分歧［9］。

有關(guān)擬南芥DELLA蛋白的研究表明，DELLA蛋白是GA調(diào)節(jié)下控制編碼毛狀體發(fā)生激活因子基因所必須的，失去功能的GAI對毛狀體發(fā)生有顯著的影響［14］。Yang等［15］對棉花中DELLA蛋白的研究發(fā)現(xiàn)，1個DELLA蛋白GAI基因在開花前3 d的表達(dá)量最高，開花當(dāng)天的表達(dá)量有較大幅度的下降，開花后3 d和開花后5 d的表達(dá)量與開花當(dāng)天相比并沒有顯著的改變，而在棉花無毛突變體中相應(yīng)的發(fā)育時期中，GAI的表達(dá)量比野生型棉花均有較大幅度的降低，說明GAI基因在棉纖維發(fā)育的過程中起到重要作用，特別是在起始時期。

本實(shí)驗(yàn)分析了DELLA蛋白基因GbGAI2在海島棉花后胚珠不同發(fā)育階段表達(dá)量的差異。發(fā)現(xiàn)GbGAI2可能對棉纖維原始細(xì)胞的起始分化以及棉纖維次生壁加厚過程中發(fā)揮作用。本研究為進(jìn)一步弄清楚DELLA蛋白對海島棉棉纖維生長發(fā)育的作用機(jī)制，提供了一些基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

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