棉花GhFTL1基因啟動子的克隆及序列分析

張定國，黃先忠，東銳，鄭銀英，崔百明

（石河子大學生命科學學院／農(nóng)業(yè)生物技術(shù)重點實驗室，石河子832003）

FT（Flowering Locus T）基因是光周期途徑中決定植物開花的重要因子。CO和FT基因在植物開花中起著關鍵作用，CO基因在長日照下能夠誘導葉片F(xiàn)T基因的表達，當FT基因在莖尖特異表達時可以促進花芽分化。FT蛋白（誘導開花的成花素信號分子）從葉片經(jīng)過韌皮部長距離運輸?shù)竭_莖頂端分生組織后，與頂端組織特異表達的Flowering Locus D（FD）基因編碼產(chǎn)物之間結(jié)合，形成一種蛋白復合體，共同促進下游成花基因Apetala 1（AP1）、Leafy（LFY）等的表達，從而促進植物開花［1］。棉花Gh FTL1基因已經(jīng)被克隆，系統(tǒng)進化分析表明Gh FTL1屬于FT亞家族成員［2］。

染色體步移技術(shù)（Genome walking）是一種重要的分子生物學研究技術(shù)，使用這種技術(shù)可以有效獲取與已知序列相鄰的未知序列。熱不對稱交錯PCR（Thermal asymmetric interlaced PCR，TAILPCR）技術(shù)［3］因快速、簡單、高效等優(yōu)點而備受青睞，目前已有大量成功報道［4］。Wang 等［5］利用 TAIL－PCR法分離了小球藻硝酸還原酶基因5′端側(cè)翼序列，將其與GUS基因融合并表達，結(jié)果顯示該側(cè)翼序列能啟動GUS基因的表達，該片段含有硝酸還原酶基因轉(zhuǎn)錄表達所必要的啟動子元件。財音青格樂等［6］通過此方法，成功地克隆了大豆種子特異性啟動子序 列 （約 700 bp）。李 秋 莉 等［7］也 應用TAIL－PCR法成功地克隆了遼寧堿蓬BADH基因的啟動子片段。Liu等［8］報道，TAIL－PCR 方法通?？梢詳U增到0.2～2.0 kb的片段。因此，TAILPCR法是克隆未知啟動子的一種有效、簡便的方法。

本實驗室已經(jīng)獲得GhFTL1基因的序列［2］，為了研究Gh FTL1基因自身啟動子的功能，利用TAIL－PCR方法從棉花基因組中分離了長度為715 bp的該基因序列片段，并對已得到的序列片段序列進行分析，旨在為進一步研究該啟動子的功能奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1植物材料

實驗材料為新疆陸地棉品種新陸早33。

1.1.2菌株和質(zhì)粒

大腸桿菌DH5α、根癌農(nóng)桿菌GV3101、植物表達載體pCAMBIA1301、p35S：：Gh FTL1為本實驗室保存。

1.2 方法

1.2.1 DNA的提取

棉花DNA提取采用CTAB法。

1.2.2引物的設計及合成

根據(jù)已知棉花FT同源（登錄號HM631972）基因的序列，設計引物（華大基因合成）（表1）用作PCR擴增。

表1 TAIL－PCR引物Tab.1 Primers of TAIL－PCR

1.2.3 pGhFTL1啟動子片段的克隆

TAIL－PCR第1輪擴增：以棉花葉片DNA為模板，在50μL的反應體系中加入DNA模板2μL，5μL 10×LA Buffer，8μL d NTP Mixture，0.5μL 5U LA Taq DNA聚合酶，以AD1為正向引物，SP1為反向引物各1μL，dd H2O補齊。第2輪擴增：將第1輪PCR反應液稀釋100倍后，取1μL作為第2輪PCR反應的模板，5μL 10×LA Buffer，8μL d NTP Mixture，0.5μL 5 U LA Taq DNA聚合酶，以AD1為正向引物，SP2為反向引物各1μL，dd H2O補齊。第3輪擴增：將第2輪PCR反應液稀釋100倍后，取1μL作為第3輪PCR反應的模板，反應體系與第2輪的相同。取上述各步PCR反應液在1%的瓊脂糖凝膠上檢測，割下目的條帶，利用凝膠回收試劑盒純化后，將回收產(chǎn)物與載體p GEM－T Easy連接。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細胞，在涂有IPTG／X－gal及氨芐抗生素的LB平板上通過藍白斑篩選，挑取陽性克隆于LB培養(yǎng)基中過夜搖菌，小量提取質(zhì)粒經(jīng)酶切鑒定后，將陽性克隆交由北京華大基因公司測序。

第1輪反應程序：94℃1 min，98℃1 min 1個循環(huán)；94℃30 s，61℃1 min，72℃2 min 5個循環(huán)；94℃30 s，25℃3 min，72℃2 min 1個循環(huán)；94℃30 s，61℃1 min，72℃2 min 94℃30 s，61℃1 min，72℃2 min 94℃30 s，44℃1 min，72℃2 min 15個循環(huán)；72℃10 min 1個循環(huán)。

第2輪反應程序：94℃30 s，61℃1 min，72℃2 min 94℃30 s，61℃1 min，72℃2 min 94℃30 s，44℃1 min，72℃2 min 15個循環(huán)；72℃10 min 1個循環(huán)。

第3輪反應程序：同第2輪反應程序。

1.2.4 GhFTL1啟動子的驗證

為了驗證所克隆的片段是GhFTL1的啟動子，從已克隆的啟動子片段中設計2個引物P－Jian－F－1：5′－TGGGGTGTGTATGCAGTTGT－3′，P－Jian－F－2，5′－GAATCACAGAAAG GGCAAGC－3′分 別和TAIL－PCR中所用到的SP1引物進行PCR驗證，以棉花葉片DNA為模板，在10μL反應體系中加入DNA模板0.5μL，1μL 10×Hotmaster Buffer，1μL d NTP Mixture，0.1μL 2.5 U Hotmaster Taq DNA 聚合酶，以 P－Jian－F－1和 P－Jian－F－2為正向引物，SP1為反向引物各0.5μL，dd H2O補齊。

PCR反應程序為：94℃30 s，61℃1 min，72℃2 min 94℃30 s，61℃1 min，72℃2 min 94℃30 s，44℃1 min，72℃2 min 15個循環(huán)；72℃10 min 1個循環(huán)。

2 結(jié)果與分析

2.1 GhFTL1啟動子片段的克隆與測序

利用引物 AD1、AD2、AD3和SP1、SP2、SP3分別進行3組3輪PCR，第3輪擴增出約為800 bp的產(chǎn)物（圖1），將第3輪PCR產(chǎn)物回收純化后連接到p GEM－T載體上，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，挑取單克隆提取質(zhì)粒經(jīng)EcoRⅠ酶切鑒定（圖2）。挑選其中陽性克隆進行測序，將800 bp的測序結(jié)果經(jīng)DNAstar軟件分析，和已知的FT序列比對，該序列確實為Gh FTL1上游啟動子序列。

圖1 Genome Walking PCR方法經(jīng)過三輪擴增后PCR片段Fig.1 PCR fragments amplified by using genome Walking PCR

圖2 pGEM－T載體上的質(zhì)粒酶切鑒定Fig.2 The restriction enzyme digestion analysis of pGEM－T vector

2.2 GhFTL1啟動子的驗證

從已克隆的啟動子片段中設計2個引物，分別與TAIL－PCR中所用到的SP1引物進行PCR驗證。將PCR產(chǎn)物用1%的瓊脂糖凝膠進行電泳。電泳結(jié)果（圖3）與預期結(jié)果一致。

圖3 PCR驗證啟動子Fig.3 PCR validation promoter

2.3 GhFTL1啟動子序列分析

通過TAIL－PCR，獲得715 bp的啟動子片段，經(jīng)Program NSITE（Softberry Inc.）序列分析表明，在該片段起始密碼子104 bp處有1個典型的TATA box，預測的轉(zhuǎn)錄起始位點在起始密碼子前69 bp處，除了有TATA box、CAAT box等基本元件外，還含有與光調(diào)節(jié)有關的元件，GT－1和SP1，另外還有如 CAr G box、GT－1＃Box7、telo－box、GS1b AC box 1等其他一些元件（圖4）以及逆境脅迫相關等的順式作用元件，通過同源克隆法先后從小擬南芥中克隆了一些耐逆基因，這些基因的啟動子中有許多逆境脅迫元件［9－11］。

植物開花受環(huán)境因素和發(fā)育狀態(tài)的控制，在擬南芥中幾種開花信號，包括光周期應答，集中在FT基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)水平上。當擬南芥FT在長日照條件的誘導下FT在葉片的維管組織中轉(zhuǎn)錄，幾種轉(zhuǎn)錄抑制子參與了FT的調(diào)節(jié)，盡管這些元件對FT調(diào)節(jié)的重要性沒有完全得到證明，但FLC的MADS box與SVP形成的復合物與FT啟動子近端區(qū)域和包含有CAr G boxe的第1個內(nèi)含子有一定的聯(lián)系［12］。FT的表達受FLC表達的抑制，這種抑制受FT啟動子的介導，在FT的啟動子中有1個CArG box。擬南芥FT基因編碼的蛋白產(chǎn)物是可以長距離轉(zhuǎn)運的成花激素，可從葉片運輸?shù)窖宽敹?，?yōu)先在芽頂端表達的FD，對FT促進開花是必需的，F(xiàn)D和FT通過蛋白互作，激活花分生組織特異性基因AP1，從而促進開花［13］。

GT元件是一個光應答元件。GT元件最初是在豌豆葉片rbcS－3A基因啟動子中被鑒定出來，其核心序列為5′－GTGTGGTTAATATG。GT－1是一種蛋白，其可與光調(diào)節(jié)基因的啟動子相互作用，分布在cab－E啟動在的7個不同為點上。在cab－E基因的啟動子內(nèi)GT－motifs是通過GT－1把他們結(jié)合在一起，rbcS－3A基因啟動子與GT－1的結(jié)合位點序列和cab－E基因的啟動子與GT－1的結(jié)合位點序列一致［14］。紫外光能能增強Tdc啟動子的表達，通過紫外光證明了GT－1在Tdc中調(diào)節(jié)的功能。PsGS1b在整個植物的維管組織中表達，在不同的新陳代中銨鹽的重新利用中起重要作用，還可在酵母、擬南芥和松樹的細胞中激活轉(zhuǎn)錄［15］。分析了PsGS1b的啟動子的403 bp的序列在該啟動子轉(zhuǎn)錄起始位點上游的1個區(qū)域含有大量的AC元件，這個區(qū)域被稱為GS1b AC box 1，其包含3種AC元件，AC元件能調(diào)節(jié)基因的表達［16］。siteⅡ和telobox是一種順式調(diào)節(jié)元件，與基因的分生表達有關。細胞循環(huán)的眾多基因啟動子中siteⅡ和telo－box之間存在保守關聯(lián)，包括幾種細胞循環(huán)有關的基因和編碼核糖體蛋白的擬南芥153基因。植物在擬南芥啟動siteⅡ元件的控制下可觀測到GUS基因的分生表達，而啟動子中的telo－box能增強這一表達。telo－box在擬南芥中編碼延長因子基因的啟動子中首次被觀測到，后來在幾種植物的RP啟動子中也發(fā)現(xiàn)了這一元件［17］，已經(jīng)確定telo－box可激活細胞循環(huán)中一組基因的誘導表達或過量表達［18］。telobox不能完全依賴自身來激活基因的表達，但要同其他順式激活序列協(xié)同作用才能發(fā)揮作用。因此，初步推斷此序列片段可能是Gh FTL1基因的啟動子。

圖4 pGhFTL1啟動子的序列分析Fig.4 Sequence analysis of Cotton pGhFTL1 gene promoter

3 結(jié)論與討論

在轉(zhuǎn)基因棉工程中，有關啟動子在棉花中的研究較多，但是大多數(shù)采用組成型啟動子。其中所應用的表達載體基本上是利用外源型啟動子Ca MV 35S。Tail－PCR、SiteFinding－PCR 等克隆技術(shù)的發(fā)展，加快了啟動子克隆的進程。近年來，世界各國正在加快棉花基因組的測序，并且隨著克隆方法的不斷改進，棉花基因組中各種類型的啟動子已被大量克隆測序，其功能也在一定程度上得到驗證。在棉花基因工程研究中，除利用外源啟動子外，越來越多的棉花內(nèi)源啟動子被開發(fā)出來，利用棉花內(nèi)源啟動子本身的特性來改良基因在棉花中的表達。

TAIL－PCR技術(shù)［13］因快速、簡單、高效等優(yōu)點而備受青睞，本實驗采用TAIL－PCR方法克隆了Gh FTL1啟動子片段。特異性引物設計基本遵循一般PCR 引物設計原則［18］，為了提高 TAIL－PCR擴增的特異性，本實驗進行了兩處重要改進：1）3條特異引物退火溫度均高于60℃，低于72℃，且3條特異引物sp1、sp2、sp3退火溫度依次升高，使第1輪及第2輪TAIL－PCR中的非特異擴增片段不能進一步有效擴增，進而提高終產(chǎn)物擴增的特異性；2）特異性引物3′末端5～10個堿基中適當提高G、C含量，尤其是3′末端5個堿基設計時不要出現(xiàn)二聯(lián)體或三連體的A或T，同時增加G或C堿基的個數(shù)，這樣可大幅減少特異引物的自身非特異擴增。本實驗采用改良的TAIL－PCR法取代5′RACE方法分離基因的5′端序列，為全長基因克隆提供了一種新選擇。改良后的TAIL－PCR技術(shù)很大程度地彌補了原TAIL－PCR技術(shù)非特異擴增高、成功率低的缺陷，通過隨機引物的篩選及特異引物設計的改進，極大地提高了TAIL超級循環(huán)中特異擴增的效率，操作簡單，3輪超級循環(huán)在1 d內(nèi)就可完成，因此該技術(shù)省時省力、快速高效。改良后的TAIL－PCR技術(shù)對試劑、儀器等的要求相對較低，一般實驗室均可滿足要求，因此該技術(shù)是進行全長基因克隆的理想選擇，具有較廣闊的應用前景。

對克隆的啟動子片段進行序列分析，在此啟動子上不僅含有TATA box和CAAT box基本元件，而且含有與光調(diào)節(jié)有關的元件，如GT－1和SP1，另還外存在一些其他元件，在該片段在起始密碼子104 bp處有1個典型的TATA box，預測的轉(zhuǎn)錄起始位點在起始密碼子前69 bp處。

［1］ABE M，Kobayashi Y，Yamamoto S，et al.FD，a bZIP protein mediating signals from the floral pathway integrator FT at the shoot apex［J］.Science，2005，309：1052－1056.

［2］東銳，院海英，顧超，等.棉花GhFTL1基因的克隆及初步功能分析［J］.棉花學報，2011，23（6）：515－521.

［3］許鋒，稱水源，王燕，等.TAIL－PCR方法快速克隆銀杏查爾酮合成酶基因及序列分析［J］.果樹學報，2007，24（2）：237－243.

［4］應革，武威，何朝族.TAIL－PCR方法快速分離Xcc致病相關基因序列［J］.生物工程學報，2002，28（2）：182－186.

［5］Wang P，Sun Y，Li X，et al.Rapid isolation and functional analysis of promoter sequence of the nitrate reductase gene from Chlorella ellipso idea［J］.J Appl Phycol，2004，16（11）：11－16.

［6］財音青格樂，李明春，蔡易，等.大豆種子特異性啟動子的分離及結(jié)構(gòu)分析［J］.中國農(nóng)業(yè)科學，2005，38（3）：454－461.

［7］李秋莉，張毅，尹輝，李丹.遼寧堿蓬甜菜堿醛脫氫酶（BADH）基因啟動子分離及序列分析［J］.生物工程學報，2006，22（1）：77－81.

［8］Liu Y G，Huang N.Effecient amplification of insert and sequences from bacterial artificial chromosome clones by thermal asymmetric interlaced PCR［J］.Plant Molecular Biology Reporter，1998，16：175－181.

［9］崔百明，李予霞，樂錦華，等.小擬南芥COR15α基因的克隆及序列分析［J］.石河子大學學報：自然科學版，2003，7（2）：178－179.

［10］任艷利，崔百明，張秀春，等.小擬南芥ApCBF基因的克隆及轉(zhuǎn)化煙草的初步研究［J］.石河子大學學報：自然科學版，2006，26（5）：591－595.

［11］黃先忠，張鵬，呂新華，等.新疆小擬南芥ApCBF1基因的克隆和過量表達轉(zhuǎn)基因的研究［J］.石河子大學學報：自然科學版，2009，27（3）：265－267.

［12］Searle I，He Y H，Turck F，et al.The transcription factor FLC confers a flowering response to vernalization by repressing meristem competence and systemic signaling in Arabidopsis［J］.GenesDev，2006，20：898－912.

［13］Corbesier L，Vincent C，Jang S，et al.FT Protein movement contributes to long－distance signaling in floral induction of Arabidopsis［J］.Science，2007，316：1030－1033.

［14］Schindler U，Cashmore A R.Photoregulated gene expression may involve ubiquitous DNA binding proteins［J］.EMBO J，1990，9：3415－3427.

［15］Josefa Gomez－Maldonado，Concepcion Avila1，F(xiàn)ernando dela Torre.Functional interactions between a glutamine synthetase promoter and MYB proteins［J］.The Plant Journal，2004，39：513－526.

［16］Go′mez－Maldonado J，Ca′novas F M，Avila C.Molecular analysis of the 5′upstream region of a gibberel lininduciblecytosolic glutamine synthetase gene（GS1b）expressed in thepine vas cular tissue［J］.Planta，2004，218：1036－1045.

［17］Axelos M，Bardet C，Liboz T，et al.The gene family encoding the translation elongation factor eEF1A：molecular cloning，characterization and expression［J］.Mol Gen Genet，1989，219：106－112.

［18］Manevski A，Bertoni G，Bardet C，et al.In synergy with various cis－acting elements，plant interstitial telomere motifs regulate gene expression in Arabidopsis root meristems［J］.FEBS Lett，2000，483：43－46.