IL－17在結(jié)直腸癌中的表達(dá)及其意義

地力下·司馬義，李峰，張文杰

（石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院病理系／新疆地方病與民族高發(fā)病教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，石河子832002）

結(jié)直腸癌是一種常見的消化道惡性腫瘤，局惡性腫瘤發(fā)病率第三位［1］。結(jié)直腸癌發(fā)病率較高的地區(qū)為歐美發(fā)達(dá)國家，澳大利亞男性和女性發(fā)病率分別為48.2／萬和36.9／10萬［2］，北美發(fā)病率為44／10萬，隨著我國工業(yè)化程度的增加，我國的結(jié)直腸癌發(fā)病率出現(xiàn)增長趨勢，男性發(fā)病率為15／10萬，女性發(fā)病率為9.7／10萬；病死率為8.6／10萬和5.4／10萬［3］。結(jié)直腸癌的發(fā)病危險(xiǎn)因素主要包括：飲食和生活方式——高脂肪、高熱量和缺乏運(yùn)動；腸道的慢性炎癥，目前已經(jīng)證實(shí)腸道的長期慢性炎癥可以進(jìn)展為癌［4］；Crohn?。环晴摅w類抗炎藥的過量使用及遺傳背景。結(jié)直腸癌的治療主要是手術(shù)切除輔以放療和化療，手術(shù)切除腸內(nèi)息肉可以有效的預(yù)防結(jié)直腸癌的發(fā)病。近年的研究發(fā)現(xiàn)IL－17在多種自身免疫性疾病及腫瘤中發(fā)揮重要作用，對IL－17的研究可以為結(jié)直腸癌的分子靶向治療提供新的思路。

IL－17的發(fā)現(xiàn)已有二十年，IL－17作為一種促炎癥因子發(fā)現(xiàn)參與多種自身免疫性疾病以及某些腫瘤的發(fā)病過程。在IL－17敲除的小鼠黑色素瘤及膀胱癌模型中腫瘤的生長速度明顯低于野生型小鼠［5］。TH 細(xì) 胞 在IL－6，IL－23，TGF－β 的 作 用 下 分 化 為TH17細(xì)胞，分泌IL－17，通過激活I(lǐng)L－17下游靶基因及信號通路，可以促進(jìn)成纖維細(xì)胞，巨噬細(xì)胞，內(nèi)皮細(xì)胞和上皮細(xì)胞增殖，促進(jìn)炎癥細(xì)胞浸潤并且擴(kuò)大炎癥反應(yīng)，最終促進(jìn)上皮細(xì)胞內(nèi)瘤變而導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生。同時TH17細(xì)胞分泌的IL－17具有促血管生成作用，與以上作用一起促進(jìn)腫瘤的發(fā)生。腫瘤組織通過釋放前列腺素2（PGE2）可以增加TH17細(xì)胞的分化，使整個過程不斷放大。但是IL－2，IL－4，IL－10，IFN－γ又可以抑制 TH17細(xì)胞的分化，從而對抗IL－17的促腫瘤作用［6－8］。由此得出，對IL－17的研究可以為腫瘤特異性分子靶向治療提供一個新思路，提示阻斷IL－17可以抑制腫瘤的發(fā)生及進(jìn)展。

1 材料與方法

1.1 材料

收集我院2004年1月1日至2008年12月31日手術(shù)切除的結(jié)直腸癌組織石蠟標(biāo)本95例，年齡范圍33歲至85歲，年齡中位數(shù)66歲。其中結(jié)腸癌43例，直腸癌42例。淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移37例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移58例。按照2000年版世界衛(wèi)生組織消化系統(tǒng)腫瘤分類標(biāo)準(zhǔn)對癌組織進(jìn)行組織學(xué)分型。其中中分化腺癌79例，低分化腺癌15例，未分化癌1例。并且取癌旁組織（切緣距離癌灶邊緣5cm以外的組織）90例作為對照組。所有患者術(shù)前均未接受放療、化療及免疫治療。

1.2 方法

采用免疫組織化學(xué)S－P法。組織標(biāo)本經(jīng)過10%福爾馬林固定，常規(guī)石蠟包埋，5μm連續(xù)切片。脫蠟水化后，用p H6.0枸櫞酸鹽緩沖液中高壓熱修復(fù)。首先將枸櫞酸鹽修復(fù)液在高壓鍋中煮沸，再放入切片，蓋上鍋蓋，高火燒至冒氣，再調(diào)至低火，電磁爐功率800W，130℃煮2 min。隨后打開鍋蓋，自然冷卻30 min。

隨后在每張切片上滴加IL－17抗體（Sant Cruz，美國，兔抗人多克隆抗體，SC－7927，稀釋比例1∶200），過夜后用PBS泡洗，滴加二抗和三抗（Ivitrogen，美國），DAB（中杉金橋）顯色，復(fù)染。

1.3 結(jié)果

光學(xué)顯微鏡（400倍）下觀察切片，抗體染色評分標(biāo)準(zhǔn)為：組織切片以細(xì)胞漿染色淺棕黃色至棕褐色為陽性。陽性細(xì)胞百分率＜5%為0分，6%～25%記為1分，26%～50%為2分，51%～75%為3分，≥75%記4分；著色強(qiáng)度，無著色為0分，淺棕黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分；評分結(jié)果計(jì)算為：陽性細(xì)胞百分率分?jǐn)?shù)×著色強(qiáng)度分?jǐn)?shù)，所得分?jǐn)?shù)為0～1分時，分級為（－）；2～4分為（＋）；5～8分為（＋＋）；9～12分為（＋＋＋）。400倍光學(xué)顯微鏡下觀察切片，隨機(jī)取3個視野計(jì)數(shù)細(xì)胞漿陽性細(xì)胞數(shù)，取其平均值來判斷IL－17的表達(dá)情況。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 使用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件，各組數(shù)據(jù)均以均數(shù)＋標(biāo)準(zhǔn)差表示。兩組間比較使用非參數(shù)檢驗(yàn)，P＜0.05差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

通過對95例結(jié)直腸癌組織和90癌旁組織的IL－17含量的檢測，我們發(fā)現(xiàn)在癌組織中IL－17的含量明顯高于癌旁組織，在癌組織中有2例IL－17表達(dá)陰性，47例陽性，46例強(qiáng)陽性；而在癌旁組織中有33例IL－17的表達(dá)為陰性，48例為陽性，沒有強(qiáng)陽性表達(dá)。差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）（表1）。隨后我們對37例淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和58例無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的癌組織進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和沒有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的組之間P＞0.05，IL－17的表達(dá)含量沒有明顯差異（表2）。另外，我們又按照分化程度，對中分化癌和低分化癌進(jìn)行比較，P＞0.05結(jié)果顯示IL－17的表達(dá)含量與分化程度沒有相關(guān)性（表3）。

表1 癌組織和癌旁組織IL－17含量對比Tab.1 Contents of IL－17 in Cancerous and paracancerous tissues

表2 淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組織IL－17含量對比Tab.2 Contents of IL－17 in lymph node meta static and non－metastatic tissues

表3 中分化腺癌與低分化腺癌IL－17含量對比Tab.3 Contents of IL－17 in moderately and poorly differentiated adenocarcinome

結(jié)腸癌組織中IL－17主要表達(dá)在細(xì)胞漿，并且IL－17的表達(dá)量與病人年齡，分化程度等并無相關(guān)性。

3 討論

IL－17作為一種促炎癥因子，于1993年首次被克隆出來，隨后被命名為IL－17［7，9－11］，后續(xù)的研究發(fā)現(xiàn)IL－17可以促進(jìn)自身免疫性疾病，并且促進(jìn)由炎癥介導(dǎo)的促腫瘤效應(yīng)。IL－17及其信號通路在乳腺癌，宮頸癌及結(jié)直腸癌中可以促進(jìn)這些腫瘤的發(fā)生過程。IL－17由CD4＋T細(xì)胞分泌，有六個亞型，分別 為 IL－17A，IL－17B，IL－17C，IL17－D，IL－17E，IL－17F。人類的IL－17A是由150個氨基酸編碼的蛋白質(zhì)，其分子量為15k Da，借助二硫鍵結(jié)合形成分子量為30－35k Da的同源二聚體［7］。IL－17A 與IL－17F有60%的同源性，編碼IL－17A和IL－17F的基因位于6號染色體［7］。IL－17A 和IL－17F 都是由TH17細(xì)胞分泌的，TH17細(xì)胞還分泌IL－21，IL－10，IL－22在機(jī)體各個組織器官中起重要作用［12］。

IL－17的分化過程為：TNF－α通過刺激APC細(xì)胞分泌IL－6及IL－23，TGF－β與IL－23作用于TH17細(xì)胞通過活化的STAT3通路分泌IL－17。STAT3通路的活化誘導(dǎo)腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞（TAM）經(jīng)由NF－κB／Rel A直接轉(zhuǎn)錄活化IL－23p19基因分泌IL－23，并且STAT3的可以活化抑制腫瘤相關(guān)的DC細(xì)胞 中 NF－κB／c－Rel 依 賴 的 IL－12p35 基 因 的 表達(dá)［13］。另一方面，TH2細(xì)胞通過活化的STAT6通路分泌IL－4，IL－12，兩者作用于TH1細(xì)胞通過活化STAT4通路分泌IFN；一同抑制TH17細(xì)胞通過活化的 STAT3 通 路 分 泌IL－17［5，14－16］。同 時 腫 瘤 組織釋放的PGE2也能促進(jìn)TH2細(xì)胞分泌IL－4，同時PGE2也可以促進(jìn)TH17的分化過程。腫瘤組織釋放的TGF－β作用于Treg細(xì)胞抑制TH17的分化。IL－17刺激中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞分泌IL－1，IL－6等細(xì)胞因子來促進(jìn)腫瘤血管生成，促進(jìn)腫瘤侵襲以及促進(jìn)腫瘤的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。同時IL－17作用于炎癥局部可以促進(jìn)局部組織增生［5］。

目前的研究均證實(shí)，IL－17及其信號通路可以促進(jìn)腫瘤的發(fā)生與進(jìn)展。TH1細(xì)胞通過分泌IFN－γ來發(fā)揮抗腫瘤免疫功能，并且可以抑制TH17細(xì)胞的分化。從而抑制IL－17的促腫瘤作用。在敲除IFN－γ的小鼠黑色素瘤、膀胱癌模型中，IL－17的表達(dá)明顯增高，而且腫瘤生長大小也明顯大于IFN－γ＋／＋的小鼠。在IL－17－／－的小鼠模型中，腫瘤生長速度及腫瘤大小均小于IL－17＋／＋的小鼠，說明IL－17的過量表達(dá)可以促進(jìn)結(jié)直腸癌的發(fā)生。而且在IL－17－／－ 的小鼠中，磷酸化的 Stat3（p－Stat3）的表達(dá)量也明顯低于野生小鼠；而IFN－γ對Stat3的活化起抑制作用。并且IL－17對Stat3的下游靶基因Bcl－2和Bcl－XL有正調(diào)節(jié)作用［5］。同時，隨著腫瘤組織中IL－17的表達(dá)增加可以促進(jìn)如血管內(nèi)皮生長因子，MMP9的表達(dá)增加，這些因子直接參與了腫瘤血管生成作用，對腫瘤的生長有重要意義。腫瘤組織中IL－17的過量表達(dá)也可以促進(jìn)炎癥細(xì)胞的浸潤，促進(jìn)成纖維細(xì)胞增殖，同時腫瘤組織中通過釋放PGE2對TH17細(xì)胞的分化有正反饋調(diào)節(jié)作用，使IL－17的促腫瘤作用不斷放大。

在IL－17的促腫瘤作用中有一個不可忽視的因素，信號傳導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄因子3。Stat3是Stat家族成員，具有很強(qiáng)的促腫瘤增殖，抗凋亡，促腫瘤血管生成作用。在腫瘤細(xì)胞中激活的Stat3促進(jìn)抗腫瘤免疫分子的表達(dá)，腫瘤組織自身也可以上調(diào)Stat3的表達(dá)，增加免疫抑制因子的表達(dá)如IL－6，IL－10，TGF－β，F(xiàn)OXP3 和 VEGF［17－19］。Stat3的持續(xù)高表達(dá)會抑制抗腫瘤免疫分子的表達(dá)。但是IL－17并不是直接激活Stat3，體外實(shí)驗(yàn)已經(jīng)證實(shí)，IL－17在腫瘤組織中首先是促進(jìn)IL－6的表達(dá)，隨后再經(jīng)由IL－6激活Stat3［15］。IL－6激活腫瘤組織中的Stat3后，可以增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞抗凋亡能力，促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移，促進(jìn)腫瘤血管生成作用，并且能夠抑制局部的促炎癥反應(yīng)。IL－17誘導(dǎo)的IL－6的高表達(dá)同時又可以促進(jìn)腫瘤組織中TH17細(xì)胞的分化，從而使整個促腫瘤反應(yīng)不斷放大反復(fù)循環(huán)。

本研究通過檢測人類結(jié)直腸癌石蠟標(biāo)本中的IL－17含量進(jìn)一步證實(shí)，IL－17可以通過其信號通路來促進(jìn)腫瘤的發(fā)生及進(jìn)展，我們的結(jié)果顯示，在癌組織中IL－17的含量要明顯高于癌旁組織，而且IL－17的表達(dá)增加并不是整個機(jī)體的表達(dá)水平增加，而是癌組織中的IL－17表達(dá)增加。這正說明在癌組織中IL－17大量積聚，通過IL－17誘導(dǎo)的IL－6的表達(dá)使Stat3磷酸化，磷酸化的Stat3（p－Stat3）具有較強(qiáng)的促腫瘤細(xì)胞增殖，抗凋亡，促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移，促進(jìn)腫瘤血管生成作用，并且可以促進(jìn)上皮內(nèi)瘤變的發(fā)生，并且促進(jìn)上皮內(nèi)瘤變向癌的進(jìn)展［4］。由此我們推測，通過在癌組織內(nèi)增加IL－2，IL－4，IL－10，IFN－γ的含量以此來抑制TH17細(xì)胞的分化，還可以通過特異性阻斷癌組織中的IL－17，從而對抗IL－17的促腫瘤作用。從而為結(jié)直腸癌的分子靶向治療提供新的思路。

［1］Parkin D M.Global cancer statistics in the year 2000［J］.Lancet Oncol，2001，2（1）：533－543.

［2］Parkin D M，Bray F，F(xiàn)erlay J，et al.Global cancer statistics，2002［J］.CA：a cancer journal for clinicians，2005，55（10）：74－108.

［3］楊玲，李連弟，陳育德，等.中國2000年及2005年惡性腫瘤發(fā)病死亡的估計(jì)與預(yù)測［J］.中國衛(wèi)生統(tǒng)計(jì)，2005，6（2）：22－27.

［4］Wu S，Rhee K－J，Albesiano E，et al.A human colonic commensal promotes colon tumorigenesis via activation of T helper type 17 T cell responses［J］.Nature medicine，2009，15（7）：1016－1022.

［5］Wang L，Yi T，Kortylewski M，et al.IL－17 can promote tumor growth through an IL－6－Stat3 signaling pathway［J］.Journal of Experimental Medicine，2009，206（2）：1457－1464.

［6］Aujla S J，Chan Y R，Zheng M，et al.IL－22 mediates mucosal host defense against Gram－negative bacterial pneumonia［J］.Nat Med，2008，14（3）：275－281.

［7］Fossiez F，Djossou O，Chomarat P，et al.T cell interleukin－17 induces stromal cells to produce proinflammatory and hematopoietic cytokines［J］.J Exp Med，1996，183（20）：2593－2603.

［8］Guzzo C，Che Mat N F，Gee K.Interleukin－27 induces a STAT1／3－and NF－B－dependent proinflammatory cytokine profile in human monocytes［J］.Journal of Biological Chemistry，2010，285（37）：24404－24411.

［9］Rouvier E，Luciani M，Mattei M，et al.CTLA－8，cloned from an activated T cell，bearing AU－rich messenger RNA instability sequences，and homologous to a herpesvirus saimiri gene［J］.The Journal of Immunology，1993，150（20）：5445.

［10］Yao Z，F(xiàn)anslow W，Seldin M，et al.Herpesvirus Saimiri encodes a new cytokine，IL－17，which binds to a novel cytokine receptor［J］.Immunity，1995，3（1）：811－821.

［11］Yao Z，Painter S L，F(xiàn)anslow W C，et al.Human IL－17：a novel cytokine derived from T cells［J］.J Immunol，1995，155（26）：5483－5486.

［12］Chang S H，Dong C.A novel heterodimeric cytokine consisting of IL－17 and IL－17F regulates inflammatory responses［J］.Cell Research，2007，15（9）：30－32.

［13］Xu M，Mizoguchi I，Morishima N，et al.Regulation of antitumor immune responses by the IL－12 family cytokines，IL－12，IL－23，and IL－27［J］.Clinical and Developmental Immunology，2010，27（2）：1－9.

［14］Wei L，Laurence A，Elias K M，et al.IL－21 is produced by th17 cells and drives IL－17 production in a STAT3－dependent manner［J］.Journal of Biological Chemistry，2007，282（40）：34605－34610.

［15］Yu H，Kortylewski M，Pardoll D.Crosstalk between cancer and immune cells：role of STAT3 in the tumour microenvironment［J］.Nature Reviews Immunology，2007，13（7）：41－51.

［16］Agache I，Ciobanu C，Agache C，et al.Increased serum IL－17 is an independent risk factor for severe asthma［J］.Respir Med，2010，104（29）：1131－1137.

［17］Kasprzycka M，Marzec M，Liu X，et al.Nucleophosmin／anaplastic lymphoma kinase（NPM／ALK）oncoprotein induces the T regulatory cell phenotype by activating STAT3［J］.Proc Natl Acad Sci U S A，2006，103（30）：9964－9969.

［18］Sumimoto H，Imabayashi F，Iwata T，et al.The BRAFMAPK signaling pathway is essential for cancer－immune evasion in human melanoma cells［J］.The Journal of experimental medicine，2006，203（7）：1651.

［19］Zorn E，Nelson E A，Mohseni M，et al.IL－2 regulates FOXP3 expression in human CD4＋ CD25＋regulatory T cells through a STAT－dependent mechanism and induces the expansion of these cells in vivo［J］.Blood 2006，108（24）：1571.