理囊散中水溶性成分的超聲提取及促孕活性研究

曾云軍，李炳奇，陳韓英，陳晴晴，谷新利

（1石河子大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院／新疆兵團(tuán)化工綠色過程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室／省部共建國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地，石河子832003；2石河子大學(xué)藥學(xué)院，石河子832003；3石河子大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，石河子832003）

奶牛不孕癥中，發(fā)情周期不正常、不發(fā)情多為卵巢性疾病，據(jù)統(tǒng)計(jì)［1－2］，因卵巢疾病引發(fā)的奶牛不孕占總數(shù)的78.5%，每年我國(guó)僅因奶牛卵巢疾病性不孕造成的經(jīng)濟(jì)損失就達(dá)數(shù)億元。獸醫(yī)臨床上治療上述病癥一般采用激素和抗生素制劑［3－7］，而這類藥物副作用大，長(zhǎng)期使用不僅危害動(dòng)物體質(zhì)，也嚴(yán)重影響著人類健康［8］。目前，中藥復(fù)方已用于治療奶牛不孕癥，如蒲林春等［9］利用加減四物湯治療奶牛不孕癥、李煥章［10］采用復(fù)方仙陽湯治療奶牛不孕癥，羅瑞卿等［11］利用促孕散治療奶牛不孕癥均取得了良好的療效［9－11］。

中藥復(fù)方理囊散，主要用于治療卵巢囊腫和排卵延遲等原因造成的奶牛不孕癥。其由香附子、女貞子、益智仁等十余味中藥組成，臨床應(yīng)用證明該復(fù)方作用效果持久，副作用小，具有促孕作用［12－13］。但作為純中藥散劑，其存在用藥量大，藥材利用率低，使用不便，質(zhì)量可控性差等缺點(diǎn)，使其推廣應(yīng)用受到了很大限制。

理囊散的主要成分為揮發(fā)油、醇溶性成分、水溶性成分［14］。本研究利用超聲輔助提取技術(shù)針對(duì)其水溶性成分進(jìn)行提取，并采用正交實(shí)驗(yàn)，以水溶性成分的干膏得率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，優(yōu)選最佳提取工藝條件，再通過觀察其對(duì)小鼠子宮系數(shù)和卵巢的影響，探討理囊散中水溶性成分的促孕活性，旨在為實(shí)現(xiàn)理囊散安全、穩(wěn)定、高效、可控的質(zhì)量要求奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

電子天平（北京賽多利斯天平有限公司）；KQ－250B型超聲清洗機(jī)（昆山市超聲儀器有限公司）；SHZ－CB循環(huán)水式多用真空泵（河南鞏義市英峪予華儀器廠）；KMD型電熱套（武漢精華科技有限公司）；電熱真空干燥箱（上海實(shí)驗(yàn)儀器廠有限公司）；AR－2140型萬分之一電子天平（梅特勒－托利多儀器有限公司制造）；顯微鏡（Olympus）。

苯甲酸雌二醇注射液（上海通用藥業(yè)股份有限公司，每支1 m L，含雌二醇2 mg，批號(hào)：110514，用甘油稀釋成50 g／m L）；21日雌性昆明種小鼠（由石河子大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，分籠飼養(yǎng)，自由飲水和進(jìn)食）；中藥復(fù)方理囊散由石河子大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院中獸醫(yī)實(shí)驗(yàn)室提供；蒸餾水（自制）。

1.2 方法

1.2.1提取方法

準(zhǔn)確稱取一定量的中藥復(fù)方粉末于錐形瓶中，加一定水，在一定的提取時(shí)間、提取溫度、提取次數(shù)下進(jìn)行超聲輔助提取，過濾，殘?jiān)匆欢ǖ奶崛〈螖?shù)提取后減壓過濾，合并濾液，轉(zhuǎn)移至已恒重的干燥蒸發(fā)皿中，水浴蒸至近干，置70℃的烘箱進(jìn)行減壓干燥至恒重，計(jì)算出干膏得率［15］（提取物的干膏質(zhì)量／復(fù)方質(zhì)量×100%）。

1.2.2單因素試驗(yàn)

1）提取溫度對(duì)浸膏得率的影響。稱取6份10.00 g中藥復(fù)方粉末，按1∶10的料液比（M∶V），加入蒸餾水超聲提取20 min，提取溫度分別為25、35、45、55、65、75℃，按照“1.2.1”中的方法，計(jì)算干膏得率。

2）提取時(shí)間對(duì)浸膏得率的影響。稱取8份10.00 g中藥復(fù)方粉末，按1∶10的料液比加入蒸餾水，提取溫度為35℃，提取時(shí)間分別為5、10、15、20、25、30、35、40 min，按照“1.2.1”中的方法，計(jì)算干膏得率。

3）料液比對(duì)浸膏得率的影響。稱取6份10.00 g中藥復(fù)方粉末，按料液比分別為1∶6、1∶8、1∶10、1∶12、1∶14、1∶16，加入蒸餾水，提取溫度35℃，提取時(shí)間為20 min，按照“1.2.1”中的方法，計(jì)算干膏得率。

4）提取次數(shù)對(duì)浸膏得率的影響。稱取6份10.00 g中藥復(fù)方粉末，按料液比為1∶10加入蒸餾水，提取溫度35℃，提取時(shí)間20 min，提取次數(shù)分別為1、2、3、4、5、6次，按“1.2.1”的方法，計(jì)算干膏得率。

1.2.3正交試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，選擇提取溫度（A）、提取時(shí)間（B）、料液比（C）、提取次數(shù)（D）為影響提取效果的主因素，以出膏量為評(píng)價(jià)指標(biāo)，用L9（34）正交表安排實(shí)驗(yàn)，因素水平表見表1。

表1 因素水平表Tab.1 The design of factors and levels in the orthogonal test

1.2.4水溶性成分的促孕活性研究

準(zhǔn)確稱取理囊散中藥粉末適量，按正交試驗(yàn)篩選出的最佳提取工藝進(jìn)行提取，收集濾液，減壓濃縮至相當(dāng)于1.0 g／m L生藥的溶液。

1）水溶性成分對(duì)小鼠子宮系數(shù)的影響試驗(yàn)［16－17］。取50只雌性小鼠，體重為9～12 g，將其隨機(jī)分成5組，分別為空白對(duì)照組、雌二醇陽性對(duì)照組、水溶性成分低、中、高劑量組（2、4和6 g／kg）。空白對(duì)照組灌服給予等體積蒸餾水；陽性對(duì)照組從第4天開始腹腔注射雌二醇，0.5 mg／kg，連續(xù)給藥7 d。水溶性成分組、理囊散組灌服給藥，每天1次，連續(xù)給藥7 d。各組小鼠于末次給藥后24 h頸椎脫臼處死，剖開腹腔，摘取其子宮并稱重，計(jì)算子宮系數(shù)。

2）水溶性成分對(duì)小白鼠卵巢的影響試驗(yàn)。取50只21日齡雌性昆明種小鼠，體重為9～12 g，將其隨機(jī)分成5組，分別為空白對(duì)照組、雌二醇陽性對(duì)照組、水溶性成分低、中、高劑量組（劑量分別為2、4和6 g／kg）。正常對(duì)照組為等體積蒸餾水；陽性對(duì)照組從第4天開始腹腔注射雌二醇，0.5 mg／kg，連續(xù)給藥7 d。水溶性成分組、理囊散組灌服給藥，每天1次，第4天劑量加倍，連續(xù)給藥7 d。各組小鼠于末次給藥后24 h頸椎脫臼處死，立即切取雙側(cè)卵巢投入10%中性福爾馬林中固定48 h，進(jìn)行常規(guī)石蠟切片，蘇木素－伊紅染色，顯微鏡下觀察其卵泡直徑。將卵泡按大、中、小三類分別計(jì)數(shù)，求其百分比。卵泡分類標(biāo)準(zhǔn)為：直徑在100μm以上為大型卵泡（相當(dāng)于成熟卵泡），直徑在100μm以下的有卵泡腔卵泡為中型卵泡（相當(dāng)于各級(jí)次級(jí)卵泡），無卵泡腔的最小卵泡為小型卵泡（相當(dāng)于初級(jí)卵泡和原始卵泡）。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1.1提取溫度對(duì)浸膏得率的影響

由圖1可知，隨著提取溫度的增加，干膏得率也隨著增加，但到55℃后增加趨于緩慢，結(jié)合節(jié)能的原因，選擇35、45、55℃進(jìn)行正交試驗(yàn)。

圖1 提取溫度對(duì)浸膏得率的影響Fig.1 Effect of temperature on extraction rate

2.1.2提取時(shí)間對(duì)浸膏得率的影響

由圖2可知，干膏得率總的趨勢(shì)為隨著提取時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸增加，但隨著時(shí)間的進(jìn)一步延長(zhǎng)，25 min后干膏得率的增長(zhǎng)急劇減緩，30 min后干膏得率的增加趨向于一條平穩(wěn)的直線，可見30 min后延長(zhǎng)提取時(shí)間對(duì)干膏得率的影響較小，因此，選擇20、25、30 min進(jìn)行正式試驗(yàn)。

圖2 提取時(shí)間對(duì)浸膏得率的影響Fig.2 Effect of time on extraction rate

2.1.3 料液比對(duì)浸膏得率的影響

由圖3可知，隨著料液比的增加，干膏得率急劇增加，但在1∶12時(shí)干膏得率達(dá)到最大值，隨后呈現(xiàn)遞減的趨勢(shì)。因此，選擇1∶12左右進(jìn)行正交試驗(yàn)。

圖3 料液比對(duì)浸膏得率的影響Fig.3 Effect of ratio of material to water on extraction rate

2.1.4 提取次數(shù)對(duì)浸膏得率的影響

由圖4可知，隨著料液比的增加，干膏得率呈現(xiàn)增加的趨勢(shì)，但提取3次，基本已提取完全，提取次數(shù)越多，溶劑量就越大，會(huì)給后處理就帶來不便。因此，選擇1、2、3次進(jìn)行正交試驗(yàn)。

圖4 提取次數(shù)對(duì)浸膏得率的影響Fig.4 Effect of times on extraction rate

2.2 正交試驗(yàn)結(jié)果

由直觀分析和方差分析結(jié)果（表2）可得，提取次數(shù)對(duì)理囊散水溶性成分的提取具有顯著影響。四因素影響的主次序是：提取次數(shù)＞提取溫度＞提取時(shí)間＞料液比。理囊散水溶性成分的最佳提取工藝為：A3B2C2D3，即提取溫度為55℃、提取時(shí)間為25 min，料液比為1∶12，提取3次。

表2 L9（34）正交設(shè)計(jì)及結(jié)果Tab.2 The orthogonal test results and analysis

表3 方差分析Tab.3 Variance analysis of orthogonal test

2.3 驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果

為了考察該工藝的優(yōu)劣性和穩(wěn)定性，采用優(yōu)選出的最佳工藝，以干膏得率為評(píng)價(jià)指標(biāo)提取3批樣品，結(jié)果分別為16.56%、16.69%、16.63%，均高于正交試驗(yàn)中各組的值，顯示此提取工藝穩(wěn)定可靠。

2.4 促孕活性試驗(yàn)結(jié)果

2.4.1水溶性成分對(duì)小鼠子宮系數(shù)的影響試驗(yàn)

由表4可知，與空白對(duì)照組相比，水溶性成分中、低2個(gè)劑量組對(duì)幼鼠子宮系數(shù)無顯著影響，高劑量組可明顯使幼鼠子宮系數(shù)增加 （P＜0.05）。

表4 各組對(duì)雌性小鼠子宮系數(shù)的影響Tab.4 Effect on the uterine of the mice in different group

2.4.2水溶性成分對(duì)小白鼠卵巢的影響試驗(yàn)

由表5可知，空白組與水溶性成分高、中、低劑量組均以中、小型卵泡居多，但水溶性成分組大型卵泡的百分比均高于空白組，高劑量組中最大卵泡直徑顯著高于空白對(duì)照組（P＜0.05）。

表5 小鼠卵巢中各種類型卵泡百分比及最大卵泡直徑Tab.5 The percentages of three typus of ovarian follicle and the max follicular Diameter

3 討論

本實(shí)驗(yàn)采用超聲提取法，單因素、正交試驗(yàn)優(yōu)化中藥復(fù)方理囊散的提取工藝，結(jié)果表明，超聲波達(dá)到省時(shí)、高效、節(jié)能的目的［18］，該工藝簡(jiǎn)單可行，可用于理囊散中水溶性成分的提取。

用小鼠子宮增重法檢測(cè)藥物的雌激素活性是常用的評(píng)價(jià)雌激素作用的方法之一，其原理主要是子宮組織含有大量的雌激素受體，雌激素或具有雌激素活性的化合物通過與受體結(jié)合，可誘發(fā)細(xì)胞內(nèi)的反應(yīng)，使子宮組織的誘導(dǎo)蛋白含量增加，表現(xiàn)為子宮組織增生變厚而使子宮增重［19－21］。但影響雌激素效應(yīng)有多種因素，為了盡量減少內(nèi)源性雌激素對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響，本實(shí)驗(yàn)選用了剛剛斷乳性且未成熟小鼠。本實(shí)驗(yàn)觀察了給藥前后小鼠子宮系數(shù)的變化，結(jié)果顯示，水溶性成分高劑量組可明顯使幼鼠子宮系數(shù)增加 （P＜0.05），說明水提物有促進(jìn)子宮發(fā)育的作用。

卵巢發(fā)育的程度主要由卵泡成熟的程度來判斷。本實(shí)驗(yàn)的小鼠卵巢變化結(jié)果表明，水溶性成分組大型卵泡的百分比均高于空白組，高劑量組中最大卵泡直徑顯著高于空白對(duì)照組（P＜0.05），但均低于陽性對(duì)照組，說明水溶性成分組發(fā)生了類似于雌二醇組的變化，但弱于陽性對(duì)照組，提示水溶性成分提取物能促進(jìn)卵巢發(fā)育，促使性成熟形態(tài)學(xué)特征提前出現(xiàn)。本實(shí)驗(yàn)確認(rèn)理囊散中水溶性成分具有一定的促孕活性，可為理囊散開發(fā)成新劑型提供了理論依據(jù)。

［1］王德忠.奶牛子宮疾病研究概況［J］.畜牧獸醫(yī)雜志，2005，24（1）：2.

［2］羅瑞卿，谷新利.中藥治療奶牛不孕癥［J］.中國(guó)奶牛，2008（10）：67－68.

［3］魯建民，陳輝，高德來，等.奶牛產(chǎn)后繁殖疾病防控措施的應(yīng)用［J］.中國(guó)奶牛，2007（12）：54－55

［4］王淑珍，李云峰.激素治療奶牛卵巢疾?。跩］.內(nèi)蒙古畜牧科學(xué)，2003，24（6）：52.

［5］Mueller K.Cystic ovarian disease in cows－diagnosis and treatment decisions［J］.Summa，Animali da Reddito，2009，4（1）：43－48.

［6］Palomar M M，Acosta J C，Salvetti N R，et al.Treatment of cystic ovarian disease with Naloxone in high production dairy cows［J］.Journal of Veterinary Pharmacology and Therapeutics，2008，31（2）：184－186.

［7］Probo M，Comin A，Mollo A，et al.Reproductive performance of dairy cows with luteal or follicular ovarian cysts after treatment with buserelin［J］.Animal Reproduction Science，2011，127（3）：135－139.

［8］李靜萍，蓋晉宏.動(dòng)物性食品中藥物殘留的危害及控制措施［J］.中國(guó)動(dòng)物檢疫，2009，24（5）：30－31.

［9］蒲林春，趙海梅.加減四物湯療奶牛不孕癥［J］.中國(guó)獸醫(yī)雜志，2007，43（5）：60.

［10］李煥章.復(fù)方仙陽湯治療奶牛不孕癥療效淺議［J］.畜牧獸醫(yī)科技信息，2007（12）：69－70.

［11］羅瑞卿，谷新利.促孕散治療奶牛卵巢疾病引起不孕癥的研究［J］.石河子大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，2009，27（4）：455－457.

［12］羅瑞卿，谷新利.理囊散治療奶牛卵巢疾病性不孕癥的試驗(yàn)研究［J］.乳業(yè)科學(xué)與技術(shù)，2009，32（5）：243－245.

［13］谷新利，羅瑞卿，李玉梅，等.中藥促孕散和理囊散的急性毒性與蓄積性毒性實(shí)驗(yàn)研究［J］.石河子大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，2009，27（5）：602－604.

［14］賈玉海.常用中藥八百味精要［M］.北京：學(xué)院出版社，2008：8.

［15］杜樹山，張錚，沈圣民，等.解毒利尿顆粒水提工藝的正交實(shí)驗(yàn)法優(yōu)選［J］.時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥，2010，21（10）：2596－2597.

［16］趙丕文，王大偉，王玲巧，等.用小鼠子宮增重法篩選淫羊藿等10種中藥雌激素樣作用的實(shí)驗(yàn)研究［J］.北京中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2006，29（10）：686－689.

［17］邵會(huì)娟，李炳奇，唐利容，等.中藥復(fù)方“促孕散”中生物堿的提取方法及其促孕活性研究［J］.石河子大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，2010：28（2）：184－188.

［18］鐘玲，尹蓉莉，張仲林.超聲提取技術(shù)在中藥提取中的研究進(jìn)展［J］.西南軍醫(yī)，2007，9（6）：84－86.

［19］Shelbymd.Assessing environmental chemicals for estrogenicity using a combination of in vitro and in vivo assay［J］.Environ Health Perspect，1996，104：1296－1300.

［20］郝慶秀，王繼峰，牛建昭，等.熟地等4味中藥的植物雌激素作用的實(shí)驗(yàn)研究［J］.中國(guó)中藥雜志，2009，34（5）：620－624.

［21］郝慶秀，王繼峰，牛建昭，等.以小鼠子宮增重實(shí)驗(yàn)考察四物湯植物雌激素樣作用的配伍規(guī)律［J］.北京中醫(yī)藥，2009，28（5）：383－386.