HPLC法測定鹽酸莫西沙星含量及其有關(guān)物質(zhì)

馬好

莫西沙星(moxifloxacin)是德國的拜耳公司研發(fā)出來的第四代的氟喹諾酮類超廣譜抗生素，第三代的抗革蘭陰性菌的活性被它保留了下來，它的8-甲氧基部分使抗革蘭陽性菌的活性得到了顯著提高，尤其是使對厭氧菌的抗菌活性得到了改善［1］。在1999年的時(shí)候德國首次上市，在2002年的時(shí)候在我國得以上市，拜復(fù)樂是其商品名［2］。因?yàn)槠淠芸焖傥?，且在體內(nèi)的分布非常的廣，較之于β-內(nèi)酰胺類抗生素，在臨床上治療相當(dāng)一部分的致病菌時(shí)莫西沙星的的療效要更好一些［3］。2009年被英國藥典收載的關(guān)于莫西沙星的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)里需要逐一的控制多個(gè)相關(guān)物質(zhì)，結(jié)構(gòu)圖詳見下圖1，一般使用的是HPLC的分析方法，然而根據(jù)其標(biāo)準(zhǔn)借助于苯基硅烷鍵合硅膠柱來測定，在對峰定位對照品里的五個(gè)雜質(zhì)進(jìn)行分離時(shí)，分離度并不理想，所以筆者構(gòu)建了通過常用的十八烷基硅烷鍵合硅膠作填充劑的HPLC的分析方法，該方法有較好的專屬性，極易操作，能夠在測定鹽酸莫西沙星的含量和相關(guān)物質(zhì)含量時(shí)使用［4］。

圖1 莫西沙星結(jié)構(gòu)

1 材料

1.1 試劑和藥品 鹽酸莫西沙星對照品(純度高達(dá)99.9%，批號是 MX-124-4)，鹽酸莫西沙星(批號是 20100603，20100601，20100602)，它的螯合物，環(huán)合酯，(RS，SR)并不是對映異構(gòu)體(批號是MX-100506-2)(制造商為江蘇的永達(dá)藥業(yè)有限公司);莫西沙星峰定位的對照品(制造商是深圳倍素特科技有限公司，批號是Y0000717，包括5～9種雜志)，甲醇(色譜純，制造商是美國的Tedia有限公司)，剩下的別的試劑都是市售分析純，所用的水是純凈水。

1.2 儀器 本次研究中使用的儀器主要有:德國賽多利斯公司生產(chǎn)的PB-20 pH計(jì)與BP190S天平;日本島津公司生產(chǎn)的UV-2041紫外分光光度計(jì)及柱溫箱;浙江大學(xué)的智能信息工程研究所生產(chǎn)的N2000色譜工作站;SPD-10Avp型紫外檢測器與LC-10ATvp型高效液相色譜儀等等。

2 方法

2.1 色譜條件與系統(tǒng)的適應(yīng)性 色譜柱是Sepax BR-C18(尺寸為250毫米×4.6毫米，5 μm);流動相是甲醇-緩沖液(是將0.5 g的四丁基硫酸氫銨、1 g的磷酸二氫鉀及3.4 g的磷酸放入1升的水里溶解而成的)(28∶72)，檢測流速是每分鐘 1.3 ml，波長是 293 nm;柱溫是 45℃;進(jìn)樣量:20 μl。

稀釋液:在500 ml的水里放入0.5 g的四丁基硫酸氫銨與1 g的磷酸二氫鉀并進(jìn)行溶解，加入2 ml的磷酸，0.05 g的無水亞硫酸鈉，在它們完全的溶解之后，加入1升的水進(jìn)行稀釋。

2.2 方法專屬性

2.2.1 分離鹽酸莫西沙星和相關(guān)的物質(zhì)的效能 在生產(chǎn)過程中，進(jìn)行鹽酸莫西沙星的合成時(shí)或許會有相關(guān)物質(zhì)的引進(jìn)，所以需要進(jìn)行分離。精密的稱定5 mg的莫西沙星峰定位對照品，放在10 ml量瓶里，放入稀釋液溶解且稀釋至刻度，搖晃均勻，取出20 μl向液相色譜儀中注入，將色譜圖(圖2-A)記錄下來，實(shí)驗(yàn)表明，莫西沙星能很好的和各種雜質(zhì)分離開來，每一種雜質(zhì)之間的分離度都超過了1.5，拖尾因子都低于2.0。結(jié)果詳見圖2(B～D)。

圖2 色譜圖

2.2.2 降解產(chǎn)物的檢出和確定 在50 ml的量瓶里放入25 mg的本品，將3%雙氧水5 ml，6 mol/L鹽酸2 ml及1 mol/L氫氧化鈉2 ml分別的加入進(jìn)去，加熱2 h后，并冷卻至室溫，將pH調(diào)節(jié)至中性，用稀釋液稀釋到刻度，搖晃均勻，將20 μL的續(xù)濾液取出并做檢測。再取適量的本品，在130℃的烘箱里進(jìn)行八小時(shí)的放置，在4 500 lx的光照條件中存放十天，取25 mg的光照與高溫放樣樣品，放在50 ml的量瓶里，取20μL的續(xù)濾液20進(jìn)樣，將色譜圖記錄下來。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，本色譜條件可以檢測出鹽酸莫西沙星的相關(guān)物質(zhì)，對本品質(zhì)量能進(jìn)行有效的控制。

2.3 定量限和檢測限 取適量的鹽酸莫西沙星，借助于稀釋液進(jìn)行溶解同時(shí)進(jìn)行逐級的稀釋，在測定時(shí)取20 μL，用信噪比(S/N)3及10分布的來明確鹽酸莫西沙星的定量限與檢測限，經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，6.25×10-3μg/ml是鹽酸莫西沙星的檢測限，0.025μg/ml則是其定量限。

2.4 耐用性試驗(yàn) 主要使用的是柱溫(±5℃)、測波長(±5 nm)、不同色譜柱及調(diào)節(jié)流動相比例(±5%)，對主峰與相鄰的雜質(zhì)峰之間的分離度進(jìn)行測量并觀察主峰的純度與拖尾因子，得出，在柱溫各異的情況下鹽酸莫西沙星的耐用性不好，但其余的色譜情況里的色譜行為都可以滿足系統(tǒng)在適用性方面的要求，有理想的耐用性。

2.5 含量測定方法學(xué)

2.5.1 線性范圍 經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，鹽酸莫西沙星在38.55～57.82 μg/ml的濃度范圍里時(shí)能夠和峰面積保持一個(gè)理想的線性關(guān)系。

2.5.2 進(jìn)樣精密度和重復(fù)性 經(jīng)研究，發(fā)現(xiàn)該測定辦法有較好的重復(fù)性與進(jìn)樣精密度。

2.5.3 穩(wěn)定性 通過實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在室溫情況下，放置樣品溶液8各小時(shí)后，溶液可以繼續(xù)保持穩(wěn)定。

3 討論

3.1 檢測波長的確定 取適量的本品原料，借助于稀釋液稀釋成10 μg/ml的溶液，在200～400 nm的波長范圍里掃描，發(fā)現(xiàn)它的紫外的吸收波長的最大值是293.6 nm，因此，我們將293 nm視為檢測波長。

3.2 選擇色譜柱 在使用苯基柱對峰定位雜質(zhì)對照品進(jìn)行測定時(shí)，發(fā)現(xiàn)有五個(gè)雜質(zhì)峰的分離度不理想，能分離出來的只有三個(gè)峰，對流動相比例是甲醇-緩沖液(23∶77)進(jìn)行調(diào)節(jié)，依然無法全部檢出五個(gè)峰全部檢出(圖略)。所以筆者構(gòu)建了通過常用的十八烷基硅烷鍵合硅膠作填充劑的HPLC的分析方法，該方法有較好的專屬性，極易操作，能夠在測定鹽酸莫西沙星的含量和相關(guān)物質(zhì)含量時(shí)使用。

3.3 控制柱溫 通過耐用性的實(shí)驗(yàn)，我們發(fā)現(xiàn)在柱溫40℃的情況下拖尾因子是0.77，而拖尾因子在柱溫為50℃時(shí)是1.74，較低的柱溫會造成色譜峰前沿長，但柱溫高的情況下會導(dǎo)致色譜峰拖尾，所以我們在進(jìn)行實(shí)驗(yàn)時(shí)應(yīng)嚴(yán)格的控制柱溫，切忌過高，避免造成拖尾。

［1］ 張亞坤，張志清，楊濤，等.鹽酸莫西沙星氯化鈉注射液在Beagle犬體內(nèi)的藥物動力學(xué).中國醫(yī)藥工業(yè)雜志，2010，4(1):3-5.

［2］ 尹華，吳建敏，俞如英，等.HPLC法測定沙納唑的含量及其有關(guān)物質(zhì).藥物分析雜志，2003，2(4):31-32.

［3］ 王銀蘭，李曉玲，楊潔.反相高效液相色譜法分析注射用鹽酸洛美沙星.寧夏醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2008，30(2):251-253.

［4］ 黃玫.反相高效液相色譜法測定鹽酸莫西沙星氯化鈉注射液的含量.現(xiàn)代醫(yī)藥衛(wèi)生，2011，1(1):29-30.