乳鼠竇房結(jié)細胞與心房肌細胞縫隙連接蛋白的表達研究

黃驥，宋治遠，張倩

心肌細胞電傳導(dǎo)主要依靠縫隙連接(gap junction，GJ)來完成。竇房結(jié)作為心臟的起搏活動中心，其GJ主要起到維持規(guī)律的激動頻率以及傳導(dǎo)激動到心房的作用［1］，目前，構(gòu)成 GJ的縫隙連接蛋白(connexin，Cx)在原代培養(yǎng)乳鼠竇房結(jié)細胞中如何表達尚不完全清楚［2-3］。本研究旨在探討原代培養(yǎng)乳鼠竇房結(jié)細胞及心房肌細胞中不同Cx的表達及其差異，為后續(xù)研究打下基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1實驗動物出生24 h內(nèi)的Wistar乳鼠，雌雄不拘，由第三軍醫(yī)大學(xué)實驗動物中心提供。

1.2儀器和試劑激光共聚焦顯微鏡(Leica公司)、羊抗人Connexin43多克隆抗體、羊抗人Connexin45多克隆抗體(Santa Cruz公司)，兔抗鼠Connexin40多克隆抗體(ADI公司)、SABC-FITC試劑盒和SABC-Cy3試劑盒(武漢博士德公司)、4%多聚甲醛液(北京益利精細化學(xué)品有限公司)。

1.3乳鼠竇房結(jié)細胞原代培養(yǎng)按本實驗室建立的原代乳鼠竇房結(jié)細胞培養(yǎng)方法進行［4-5］。

1.4實驗分組取培養(yǎng)48 h的乳鼠竇房結(jié)細胞進行Cx45、Cx43及 Cx40檢測，隨機分為 Cx45組、Cx43組、Cx40組。另取培養(yǎng)48 h乳鼠心房肌細胞進行培養(yǎng)，作為對照組，隨機分為Cx45組、Cx43組、Cx40組。1.5免疫細胞化學(xué)處理①每孔細胞用4%多聚甲醛2 ml在室溫下固定30 min，吸出固定液，用PBS液清洗5 min×3次。②每孔中滴加1:20的PBS液稀釋的正常兔血清封閉液1 ml，室溫20 min。甩去多余液體，不洗。③滴加適當(dāng)稀釋的一抗，4℃過夜。PBS液洗10 min×3次(不同的一抗實驗選擇相同的一抗?jié)舛?，分別是Cx45為1:300、Cx43為1:300和Cx40為1:300)。④滴加二抗(1:100)，37℃30 min，PBS液洗10 min×3次。⑤滴加試劑 SABCFITC 或 SABC-Cy3(1:100 PBS)，37℃ 孵育 30 min，PBS液洗10 min×3次。⑥30%緩沖甘油封片;以上操作均避光進行。隨機取細胞爬片中央?yún)^(qū)20個梭形細胞作為研究對象。實驗時Cx45用FITC熒光標(biāo)記，Cx43用Cy3標(biāo)記，Cx40用FITC標(biāo)記。

1.6激光共聚焦檢測用激光共聚焦顯微鏡(Leica，TCS，NT)對經(jīng)免疫細胞化學(xué)法處理的原代培養(yǎng)乳鼠細胞進行檢測。FITC在490～495 nm激化，在520～530 nm發(fā)射黃祿色，呈熒光。Cy3在554 nm激化，在568～574 nm發(fā)射鮮紅色，呈現(xiàn)熒光。用于圖像采集的顯微鏡物鏡為40×油鏡，數(shù)值孔徑為1.3，主要參數(shù)如下:小孔孔徑225 μm，X軸掃描點數(shù)400，Y 軸掃描點數(shù)400，掃描步徑0.6 μm，掃描強度55%，激光強度300 mW。

多通道掃描記錄每個圖像(512×512像素)。每個細胞用相同的一抗和二抗?jié)舛?，并用同樣的掃描參?shù)掃描。每個細胞分層掃描(20層)及熒光信號疊加形成圖像，熒光定量數(shù)據(jù)由激光共聚焦顯微鏡自帶Quantify software采集分析所得。Cx熒光強度陽性定義為在0～255灰階強度中超過其閾值50［6］，Cx 定量如［7，9］文獻所述，將數(shù)字化圖像儲存于計算機，待實驗結(jié)束后進行圖像分析。

1.7統(tǒng)計學(xué)處理采用統(tǒng)計軟件SPSS 10.0進行統(tǒng)計學(xué)處理，計量資料以(s)表示，兩組均數(shù)的比較采用t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1原代培養(yǎng)乳鼠竇房結(jié)細胞Cx的分布用激光共聚焦顯微鏡對經(jīng)免疫細胞化學(xué)法處理的乳鼠竇房結(jié)細胞檢測發(fā)現(xiàn)，Cx45免疫信號主要分布在胞膜上，表現(xiàn)為大小不一、不連續(xù)的熒光團、斑片狀或散在的熒光點，在胞漿中有微量的分布(圖1);Cx43免疫信號也主要分布在胞膜上，呈不連續(xù)的、大小不一的熒光點或斑片狀，細胞漿中僅微量的信號表達(圖2);Cx40免疫信號分布少，為大小不一、不連續(xù)的熒光點散在于胞膜上，而胞漿中幾乎沒有分布(圖3)。

2.2原代培養(yǎng)乳鼠心房肌細胞Cx的分布用激光共聚焦顯微鏡對經(jīng)免疫細胞化學(xué)法處理的乳鼠心房肌細胞檢測發(fā)現(xiàn)，心房肌細胞以Cx40分布最為明顯，主要在胞膜上，呈不連續(xù)的、大小不一的熒光點或斑片狀分布，胞漿中僅有微量的信號分布(圖4);心房肌細胞Cx45及Cx43的分布稀少，在胞膜上呈不連續(xù)的、大小不一的熒光點或熒光斑片(圖5、6)。2.3免疫熒光定量分析免疫熒光定量分析顯示，乳鼠竇房結(jié)細胞Cx45免疫信號比心房肌細胞中高7.8倍(P＜0.01)，而Cx40的免疫信號則較心房肌細胞低4.0倍(P＜0.01)(表1)。

3 討論

圖1 乳鼠竇房結(jié)細胞Cx45的表達 圖2 乳鼠竇房結(jié)細胞Cx43的表達 圖3 乳鼠竇房結(jié)細胞Cx40的表達

圖4 乳鼠心房肌細胞Cx40的表達 圖5 乳鼠心房肌細胞Cx43的表達 圖6 乳鼠心房肌細胞Cx45的表達

表1 原代培養(yǎng)乳鼠竇房結(jié)細胞和心房肌細胞Cx表達的比較(s，n=10)

表1 原代培養(yǎng)乳鼠竇房結(jié)細胞和心房肌細胞Cx表達的比較(s，n=10)

注:與心房肌細胞比較，aP＜0.01

Cx45 Cx43 Cx40竇房結(jié)細胞 86.46±5.76a 40.38±2.76 18.44±3.12組別a心房肌細胞10.28±2.13 26.34±4.86 65.25±7.86

縫隙連接(GJ)廣泛分布于各種動物組織細胞之間，偶聯(lián)細胞間相互通訊，包括電偶聯(lián)和代謝偶聯(lián)。由縫隙連接蛋白(Cx)組成的GJ形成細胞間的通道，介導(dǎo)激動從竇房結(jié)到達心肌細胞。心肌細胞各種Cx分布有區(qū)域性變化，這有助于正常心肌激動傳導(dǎo)的各向異性和心房、心室規(guī)則的收縮和舒張。

研究發(fā)現(xiàn)竇房結(jié)中Cx的種類和量的多少與結(jié)內(nèi)實質(zhì)細胞的不均一性分布有關(guān)［10］。從竇房結(jié)的中心到周邊，細胞形態(tài)是逐漸改變的，其中出現(xiàn)了過渡細胞(既像P細胞又像心房肌細胞)。由竇房結(jié)中央到邊緣，上述三種Cx的種類和量的多少并不一致［11］。位于竇房結(jié)中心的P細胞被認為是典型的起搏細胞，這種細胞不僅小并且“空”，由于竇房結(jié)結(jié)構(gòu)上的不均一性，大多數(shù)對竇房結(jié)細胞的研究未區(qū)分竇房結(jié)中央?yún)^(qū)和外周區(qū)細胞，均推測研究的都是中央?yún)^(qū)細胞。本實驗室以前的研究經(jīng)過形態(tài)及電生理檢查證明我們培養(yǎng)的原代乳鼠竇房結(jié)細胞中的梭形細胞可能就是中央?yún)^(qū)P細胞［4-5］。

對多種動物研究發(fā)現(xiàn)，Cx45主要分布在竇房結(jié)和心臟傳導(dǎo)系統(tǒng)［9，12］。本研究發(fā)現(xiàn)原代培養(yǎng)乳鼠竇房結(jié)細胞中Cx45的信號強度是心房肌細胞的7.8倍，這一結(jié)果支持在乳鼠竇房結(jié)細胞中主要表達Cx45的結(jié)論［2］。本研究同時還發(fā)現(xiàn)對照組乳鼠心房肌細胞Cx45表達為陰性，與國內(nèi)的報道是一致的［12］。

多數(shù)研究認為在竇房結(jié)中至少在中央?yún)^(qū)細胞中Cx43是不存在的［13］。但是本研究發(fā)現(xiàn)在原代培養(yǎng)的乳鼠竇房結(jié)細胞中有Cx43中量表達，與以前的文獻報告結(jié)果不同，其原因可能為:①動物種屬的區(qū)別;②本研究用新生的乳鼠進行研究，而大鼠Cx43在不同的發(fā)育階段其表達是有改變的(即增齡性改變)，而在新生鼠中表達可能較高［6，10］;③可能與使用的單克隆抗體或多克隆抗體有關(guān);④沒有免疫標(biāo)記并不意味著就不存在，這是因為竇房結(jié)中GJ可能本來就小，如果小到超過免疫標(biāo)記的底線就不會有表達;⑤從功能上講，Cx43與Cx45在竇房結(jié)細胞間形成異質(zhì)性通道，更有利于竇房結(jié)中央?yún)^(qū)向外周的電傳導(dǎo)［14］，故提示不同種動物的不同組織由于功能不同，其Cx組成的GJ具有不同的組成。

文獻報道Cx43在乳鼠心房肌細胞表達較弱，與本研究結(jié)果相似［15-16］?，F(xiàn)有研究發(fā)現(xiàn)心房肌細胞中主要表達Cx40［17］，本研究也顯示對照組心房肌細胞Cx40表達豐富，是竇房結(jié)細胞的4倍，表明Cx40是乳鼠心房肌細胞主要的Cx。

近年來，用免疫電鏡、免疫熒光、電生理技術(shù)等均證實竇房結(jié)內(nèi)有 GJ和 Cx［1，6-7］，本研究結(jié)果也支持在竇房結(jié)組織中存在GJ的觀點，此可能與竇房結(jié)細胞中橋粒等閏盤力學(xué)結(jié)構(gòu)可能不發(fā)達，而電學(xué)結(jié)構(gòu)相對完善的特性有關(guān)。

當(dāng)細胞分離培養(yǎng)時，GJ不會分解而是保存其完整結(jié)構(gòu)，只是在膜上快速封閉而維持在膜上的位置。在兔心肌細胞中表面連接無胞吞作用，也無GJ泡［17］的移動，且長達 22 h 也無新的 GJ形成［18］。因此，可以想象在細胞分離培養(yǎng)時，GJ仍保持穩(wěn)定。本研究采用原代培養(yǎng)的乳鼠竇房結(jié)細胞，不是急性分離的細胞，從分離、培養(yǎng)到固定的時間長于急性分離實驗。培養(yǎng)的心肌細胞中，Cx和GJ的分布與培養(yǎng)的時間有關(guān)［19］，本研究采用培養(yǎng)48 h這個時間點，在大鼠的心室肌細胞中已證明能使Cx位于細胞膜上，且心肌細胞中Cx是一致地分布于閏盤。故根據(jù)在普通心肌細胞上的資料，推測在原代培養(yǎng)的乳鼠竇房結(jié)細胞中GJ將接近原來的位置而得到保存。在激光共聚焦檢查時，熒光點的部位能夠反映GJ的原始分布和它們的Cx組成。但很明顯，細胞的分離過程可能會改變Cx的表達，單個細胞上GJ和Cx的數(shù)目可能要少于急性分離的細胞，更少于完整組織中擁有的GJ數(shù)目。

綜上，在原代培養(yǎng)乳鼠竇房結(jié)細胞和心房肌細胞中研究了Cx45、Cx43和Cx40的表達，發(fā)現(xiàn)乳鼠竇房結(jié)細胞中以Cx45表達為主，而心房肌細胞主要是Cx40表達，為更進一步了解竇房結(jié)的生理功能提供幫助。

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