脂肪來源干細(xì)胞移植與急性心肌梗死研究現(xiàn)狀

陳宇，樸海南

急性心肌梗死(acute myocardial infarction，AMI)是臨床危重癥，治療難度大，致殘率、病死率均較高，嚴(yán)重危害人們的身心健康，也給社會醫(yī)療衛(wèi)生事業(yè)帶來了沉重的負(fù)擔(dān)。目前，臨床廣泛應(yīng)用的最有效救治手段仍為在一定時間窗內(nèi)進(jìn)行冠狀動脈血運(yùn)重建，以挽救瀕死心肌。但顯而易見的是，心肌凋亡和壞死的啟動已造成不可逆損傷，梗死心肌的功能缺失及結(jié)構(gòu)重塑均成為目前臨床治療難以逾越的障礙。而事實上，應(yīng)該接受血運(yùn)重建的患者中僅有約半數(shù)接受了及時的血運(yùn)重建術(shù)［1］。再生醫(yī)學(xué)的發(fā)展卻獨(dú)辟蹊徑，直截了當(dāng)?shù)刂赋隽艘粭l可能的未來之路--心肌細(xì)胞成形術(shù)。

在干細(xì)胞研究蓬勃發(fā)展的大背景下，細(xì)胞治療從實驗室到臨床，從分子生物學(xué)水平到細(xì)胞生理學(xué)研究，向我們展示出在急性心肌梗死治療應(yīng)用領(lǐng)域的廣闊前景。利用干細(xì)胞多向分化的潛能進(jìn)行組織或器官的修復(fù)成為可能。目前，多數(shù)實驗提示干細(xì)胞移植治療心肌梗死，能夠改善心肌梗死后心功能、提高患者生活質(zhì)量。在這些實驗中，移植用“種子”細(xì)胞的選擇亦不盡相同。自2001年ZUK等［2］從人吸脂術(shù)來源的脂肪組織中獲得具有間質(zhì)細(xì)胞表型特點(diǎn)和多向分化潛能的獨(dú)特細(xì)胞群(PLA Cells)以來，對脂肪來源干細(xì)胞(adipose-derived stem cells，ADSCs)的研究和應(yīng)用迅猛發(fā)展。ADSCs以其獨(dú)特的優(yōu)勢(易取材、獲取簡便、患者容易接受、不涉及倫理問題)得到研究者的推崇。

1 脂肪來源干細(xì)胞及其作為“種子”細(xì)胞的研究

ZUK等［2］在2001年從人吸脂術(shù)取得的脂肪組織中分離出一群特殊的細(xì)胞群，并將其命名為processed lipoaspirate cells(PLA Cells)。在體外培養(yǎng)擴(kuò)增，表現(xiàn)出良好的增殖能力與多向分化的潛能。體外擴(kuò)增后，表現(xiàn)出成纖維細(xì)胞樣的細(xì)胞形態(tài)，進(jìn)行免疫組化，SMA、FⅧ、ASO2分子表達(dá)均為陽性，表現(xiàn)出纖維母細(xì)胞的分子特征。根據(jù)其研究，認(rèn)為這類細(xì)胞可能成為細(xì)胞治療新的候選“種子”。在次年的研究論文中，ZUK更進(jìn)一步提出人脂肪組織是可獲取多能干細(xì)胞的來源之一，它們和當(dāng)時已經(jīng)有較多研究的間充質(zhì)干細(xì)胞一樣，同樣來源于中胚層。通過RT-PCR、Western Blot技術(shù)從基因表達(dá)層面證明其具有多向分化的能力［3］。在他們的實驗中，將PLA cell與人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(MSC)進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)許多共同的CD分子標(biāo)記，但也有其獨(dú)特的分子表達(dá)。如:PLA cell表達(dá)CD49而MSC未見表達(dá)，而BMC表達(dá)的CD106在PLA中卻未見表達(dá)(表1)。

應(yīng)用各種不同的誘導(dǎo)劑和方法可使PLA細(xì)胞向諸如骨、軟骨、神經(jīng)、肌細(xì)胞的祖細(xì)胞方向橫向分化。國內(nèi)段煉等［4］亦通過對成人脂肪干細(xì)胞的體外培養(yǎng)、傳代研究了其生物學(xué)特性，發(fā)現(xiàn)ADSCs具有間充質(zhì)細(xì)胞的特征，但不表達(dá)造血干細(xì)胞的特征分子(CD31、CD45等)，體外擴(kuò)增傳代后仍穩(wěn)定的表現(xiàn)為二倍體核型，成瘤風(fēng)險低，且由于未見主要免疫原性分子的表達(dá)，推測具有免疫逃逸特性，可用于異體移植。在實際研究中發(fā)現(xiàn)ADSCs基本上是一組以原始間質(zhì)細(xì)胞為主的混雜細(xì)胞群。事實上，對于ADSCs的研究已不僅僅局限于組織再生，在免疫調(diào)節(jié)方面也有相關(guān)的報道。Kang等［5］以ADSCs與宿主免疫細(xì)胞共同培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)上清液中存在可溶性細(xì)胞因子，部分炎性因子(如TNF-α)含量降低，而IL-6、TGF-β、IFN-γ含量則顯著增加，即使在促細(xì)胞分裂素存在的情況下，白細(xì)胞的增殖仍然受到抑制。這些研究無疑展示出ADSCs作為移植用供體細(xì)胞的合理性和優(yōu)越性。

表1 未經(jīng)誘導(dǎo)的PLA細(xì)胞CD分子的表達(dá)(流式細(xì)胞儀)

2 ADSCs向心肌樣細(xì)胞的分化研究

在早期的ADSCs研究中，就已經(jīng)發(fā)現(xiàn)諸如cTNI、cTNT、β-MHC、ANP、β-action等肌源性或心肌特異性分子的表達(dá)。許多體外應(yīng)用誘導(dǎo)劑促ADSCs向心肌樣細(xì)胞分化的實驗得到了更具心肌細(xì)胞特性的細(xì)胞。常用誘導(dǎo)劑或方法:5-氮雜胞苷(5-aza)、某些細(xì)胞因子、心肌細(xì)胞或提取液共培養(yǎng)法等。張衛(wèi)澤等［6］觀察AngⅡ?qū)DSCs的誘導(dǎo)分化作用并從形態(tài)學(xué)、免疫組化分析上與5-aza相比較，發(fā)現(xiàn)AngⅡ在誘導(dǎo)ADSCs分化為心肌樣細(xì)胞效能上與5-aza相當(dāng)，但AngⅡ誘導(dǎo)后未見細(xì)胞毒性，ADSCs凋亡遠(yuǎn)少于5-aza組，且AngⅡ還有促進(jìn)ADSCs聚集生長的效應(yīng)。甚至在國內(nèi)和國外均有部分研究者稱ADSCs分化的心肌樣細(xì)胞具有類似心肌的自律性特征。張端珍等［7］以5-aza對ADSCs進(jìn)行體外誘導(dǎo)見到類似心肌細(xì)胞的節(jié)律性搏動。Metzele等［8］則以人ADSCs在體外與鼠壞死心肌細(xì)胞共培養(yǎng)見到具有節(jié)律收縮性的細(xì)胞。但是，在ADSCs的體外培養(yǎng)及向心肌細(xì)胞的誘導(dǎo)分化實驗中大多數(shù)報道卻并未見到自發(fā)節(jié)律性搏動的心肌樣細(xì)胞。關(guān)于誘導(dǎo)心肌樣細(xì)胞的鑒定方法主要集中于CD分子特征、特異蛋白及mRNA的表達(dá)等生物分子學(xué)水平。就目前的實驗而言，還難以在體外獲得一個由ADSCs分化而來的具有完整的肌絲、肌漿網(wǎng)等結(jié)構(gòu)并完全具備自律性、收縮性、傳導(dǎo)性、興奮性、舒張性的心肌細(xì)胞。

3 心肌梗死后心肌ADSCs移植的研究

在上述體外實驗進(jìn)行的同時，心肌梗死后ADSCs移植的研究也在蓬勃發(fā)展。Fraser等［9］的研究小組將新分離的ADSCs以LacZ進(jìn)行標(biāo)記后移植給心肌梗死后的鼠模型，觀察發(fā)現(xiàn)在鼠心肌梗死區(qū)見到相當(dāng)數(shù)量的LacZ陽性細(xì)胞，并且這些LacZ陽性細(xì)胞可與宿主細(xì)胞融合，也表達(dá)Nkx2.5、肌鈣蛋白I、肌球蛋白重鏈等心肌特異蛋白分子，宿主心臟功能亦得到了改善。Hwangbo等［10］也對心肌梗死的鼠進(jìn)行了脂肪干細(xì)胞移植，他們做了多方面指標(biāo)的測定，包括超聲心功能評價(FS、EF、LVESD、LVEDD)、組織學(xué)評價(梗死區(qū)毛細(xì)血管密度觀察)、免疫組化檢測，較為全面的反映了移植后梗死心肌的功能、重構(gòu)等問題。在他們的實驗中，采取于心肌梗死后一周行細(xì)胞移植，并分別于移植后1天、1周、2周和4周行心臟超聲檢查。實驗觀察到EF、FS在移植后第4周明顯優(yōu)于PBS對照組(P＜0.05)，心室肌厚度也優(yōu)于PBS組(P＜0.01)，局部血管增生密度高于 PBS組(P＜0.01)。這些結(jié)果充分說明ADSCs移植在心肌梗死治療中的有益作用。Leobon等［11］則利用他們改進(jìn)的方法培育出脂肪來源的心肌樣細(xì)胞并移植于鼠的急性梗死心肌中，同樣觀察到心臟功能、組織學(xué)結(jié)構(gòu)得到改善。另一方面的實驗有van der Bogt等［12］以ADSCs和BM-MSCs分組移植于鼠梗死心肌(心肌梗死后立即移植)，報告兩組與對照組比較并未見心功能有明顯改善和獲益，而且觀察到移植細(xì)胞的大量死亡。就在同年，Cai等［13］卻發(fā)表了觀點(diǎn)不同的報道。根據(jù)他們的研究結(jié)果，ADSCs移植后促進(jìn)梗死區(qū)血管再生和神經(jīng)芽生，有效的保護(hù)了心功能。移植細(xì)胞可持續(xù)存活達(dá)到1月，但沒有證據(jù)表明這些細(xì)胞可直接轉(zhuǎn)化為宿主的心肌組織而發(fā)揮替代作用。而這一觀點(diǎn)得到了國際脂肪治療科學(xué)聯(lián)合會的認(rèn)同。國內(nèi)學(xué)者李賓公等［14］亦于較早進(jìn)行了ADSCs移植治療大鼠急性心肌梗死的研究，其結(jié)果表明ADSCs可以促進(jìn)梗死后心肌的血管再生，改善心臟功能，同時也觀察到移植后梗死局部某些細(xì)胞因子(如VEGF)的表達(dá)水平升高。目前研究的主流報道依然顯示出ADSCs移植在心肌梗死治療中的有益作用［15-20］。

4 ADSCs移植改善心功能的機(jī)制探討

從上述一系列的研究中不難看出，各家對ADSCs移植后心臟功能的改善程度是不盡相同的。但比較一致的觀察結(jié)果是移植細(xì)胞很少在體內(nèi)形成具有完備功能的再生心肌從而發(fā)揮替代作用。大多數(shù)植入的干細(xì)胞都會隨著時間的延長而死亡。正如前述van der Bogt等的研究，即使在那些細(xì)胞移植后心功能得到改善的研究中也極少發(fā)現(xiàn)心肌組織的大面積再生，或者說植入干細(xì)胞轉(zhuǎn)化為宿主心肌而發(fā)揮相應(yīng)的功能。在心肌梗死的急性期，梗死區(qū)及其周圍的內(nèi)環(huán)境是相當(dāng)不穩(wěn)定的。大量的炎性細(xì)胞隨著各種炎性趨化因子的濃度升高向梗死區(qū)聚集，加重心肌細(xì)胞的損傷。而干細(xì)胞植入后兩周內(nèi)僅有少于2%的植入細(xì)胞能存活下來，因此，其有效性機(jī)制的研究重點(diǎn)已轉(zhuǎn)向植入干細(xì)胞的旁分泌因子［21］。Kang等［5］發(fā)現(xiàn)犬ADSCs與壞死心肌細(xì)胞培養(yǎng)的上清液能夠抑制宿主免疫細(xì)胞的增殖，進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)其中含有的可溶性細(xì)胞因子有免疫調(diào)節(jié)的作用，減輕炎性反應(yīng)。Shah［22］概括干細(xì)胞治療改善心功能的機(jī)制為三個方面:血管再生、心肌再生、免疫調(diào)節(jié)(抑制炎癥)，而這三方面作用又發(fā)揮其下游效應(yīng)-心肌細(xì)胞凋亡減少、瘢痕增生減輕(優(yōu)化重構(gòu))。以目前的認(rèn)識，干細(xì)胞的血管內(nèi)皮樣細(xì)胞及心肌樣細(xì)胞分化、旁分泌功能主導(dǎo)了上述三個促使心功能改善的機(jī)制。而由于干細(xì)胞植入后，存活或者心肌樣分化的細(xì)胞數(shù)量極少(如前述)，旁分泌作用的地位自然就突顯出來了。近十年的研究，認(rèn)識到ADSCs的有益作用與其分泌的各種細(xì)胞因子是密不可分的。在實驗中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的可溶性分子包括肝細(xì)胞生長因子、粒細(xì)胞及巨噬細(xì)胞集落刺激因子、腫瘤壞死因子、血管內(nèi)皮生長因子、IL-6、IL-7、IL-8、IL-11、神經(jīng)生長因子、脂肪因子及其他多種未被鑒定的分子［23］。研究者提出心肌梗死后治療，細(xì)胞還是生長因子的選擇問題，顯然是想探討在實際情況下更為直接有效的心肌梗死的生物治療途徑。Kang等［24］則在心肌梗死后接受冠脈支架置入術(shù)的患者中開展了臨床實驗。他們將以接受支架置入術(shù)的患者隨機(jī)分為周圍血干細(xì)胞冠脈內(nèi)注入組、粒細(xì)胞集落刺激因子(G-CSF)+周圍血干細(xì)胞冠脈內(nèi)注射組、對照組。通過對心功能和冠狀動脈血運(yùn)重建的評測發(fā)現(xiàn)，G-CSF并沒有加重炎癥反應(yīng)和缺血，G-CSF+細(xì)胞治療組及細(xì)胞治療組運(yùn)動耐量及左室射血分?jǐn)?shù)較對照組均明顯改善，但在G-CSF+細(xì)胞治療組支架內(nèi)再狹窄發(fā)生率卻顯著增加，實驗亦因此而被終止。Prosper［25］指出雖然細(xì)胞再生和細(xì)胞因子應(yīng)用于治療心肌梗死極具新意和吸引力，但應(yīng)該將臨床安全性放在首要位置，以患者獲益為最終目標(biāo)。van Dijk等［26］在研究中還發(fā)現(xiàn)心肌梗死后纖連蛋白在梗死區(qū)及其周邊表達(dá)增加，而這種蛋白可促使ADSCs粘附聚集和增殖，從而可能促進(jìn)梗死局部心肌的修復(fù)。可見，目前對干細(xì)胞及其分泌因子在體內(nèi)的具體效應(yīng)和總體作用并不十分清楚也難以準(zhǔn)確把握，單純地把ADSCs或其它種類多能干細(xì)胞移植在AMI治療中表現(xiàn)的獲益歸結(jié)為某一種機(jī)制的作用是不恰當(dāng)?shù)??？傊?，以系統(tǒng)觀來看待和應(yīng)用實驗室得到的成果，需要了解在AMI時局部內(nèi)環(huán)境特殊而劇烈的變化(炎癥、缺血)甚至是整個機(jī)體的變化(應(yīng)激)［27-29］;而ADSCs在此種環(huán)境下的生物學(xué)行為的調(diào)控仍是須要面對的難題。如前提到的部分研究者［5，30］用壞死心肌或心肌細(xì)胞裂解液與脂肪干細(xì)胞共培養(yǎng)來觀察其分化和細(xì)胞因子的表達(dá)就部分地模擬AMI時的內(nèi)環(huán)境。從諸多的研究中，我們了解到AMI時的局部內(nèi)環(huán)境可以導(dǎo)致植入的ADSCs死亡，但另一方面，其中的部分因子又誘導(dǎo)ADSCs向心肌樣細(xì)胞分化并分泌諸如抗凋亡、抗炎、多種生長因子改善細(xì)胞間質(zhì)環(huán)境、促進(jìn)修復(fù)。

5 問題和展望

脂肪干細(xì)胞的發(fā)現(xiàn)及研究在時間上晚于造血干細(xì)胞和骨髓干細(xì)胞，但其表現(xiàn)出的部分優(yōu)越性卻有目共睹，尤其給更便捷地臨床應(yīng)用帶來了希望。無數(shù)事實告訴我們，在臨床治療中“無損害”原則應(yīng)是醫(yī)者具備的基本素質(zhì)，而ADSCs治療的安全性仍存爭議，成瘤性、致心律失常和支架內(nèi)再狹窄都缺乏長期的觀察，因此也是值得關(guān)注的問題。所以ADSCs治療方法真正走向臨床仍有相當(dāng)長的道路。目前，關(guān)于心肌梗死后細(xì)胞植入的最佳時機(jī)和細(xì)胞量(密度)均無定論，干細(xì)胞植入途徑和方法也有待探討;一批新型生物工程材料的出現(xiàn)及技術(shù)改進(jìn)也給干細(xì)胞移植載體提供了新的選擇?？傊?，ADSCs用于治療急性心肌梗死是一個嶄新的領(lǐng)域，它給我們帶來進(jìn)一步改善心梗預(yù)后的希望，同時也帶動了對ADSCs自身的潛能更深入的研究。

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