巨噬細(xì)胞表型偏移相關(guān)標(biāo)志物在大鼠心肌梗死區(qū)的動(dòng)態(tài)表達(dá)

張 玲 ，羅悅晨 ，周 欣 ，李玉明

（1.天津醫(yī)科大學(xué)研究生院，天津 300070；2.武警后勤學(xué)院附屬平津醫(yī)院心臟中心，武警部隊(duì)心血管病研究所，天津 300162）

近年來的研究顯示單核巨噬細(xì)胞在心肌梗死后的炎癥反應(yīng)和組織修復(fù)中發(fā)揮著重要的作用[1-3]。巨噬細(xì)胞有M1（經(jīng)典激活型，classical activation macrophages）和 M2（替代激活型，alternative activationmacrophages）[4-11]兩種表型。這兩種表型細(xì)胞在急性心肌梗死（acutemyocardial infarction，AMI）后的心肌修復(fù)過程中發(fā)揮著相輔相成的作用，包括清除細(xì)胞碎片、促進(jìn)血管生成、成纖維細(xì)胞激活和增殖以及促進(jìn)膠原代謝等病理生理學(xué)變化。本文旨在探討AMI后不同時(shí)間點(diǎn)梗死區(qū)內(nèi)巨噬細(xì)胞表型偏移相關(guān)標(biāo)志物[趨化因子配體-2（Ccl2）、趨化因子配體-5（Ccl5）、精氨酸酶-1（Arg-1）以及白介素-10（IL-10）]的變化規(guī)律，為以巨噬細(xì)胞表型變化為靶點(diǎn)的干預(yù)策略提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組 成年雄性清潔級Wistar大鼠，周齡 6～8周，體重 170～200 g，由中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，許可證號：SCXK-（軍）2007-004。

1.2 主要試劑和儀器 TRIZOLReagent（美國Invitrogen M-MLV Promega SYBR green（瑞士Roche），小動(dòng)物呼吸機(jī)（美國HARVARD），心電監(jiān)測儀（美國 BioPAC Systems），紫外分光光度計(jì)（美國Thermo-Fisher），ABI7300熒光定量PCR儀（美國Applied Biosystems）。

1.3 AMI模型建立 按照本實(shí)驗(yàn)室建立AMI模型的方法[12]，主要步驟如下：腹腔注射0.4%戊巴比妥鈉（40mg/kg）麻醉動(dòng)物，連接心電監(jiān)測儀，沿胸骨左緣剪斷左側(cè)第4肋骨，鈍性分離心包膜，快速將心臟擠出胸腔，結(jié)扎冠狀動(dòng)脈前降支根部，結(jié)扎成功后可見心電圖示ST段進(jìn)行性弓背樣抬高，然后迅速將心臟放回胸腔；假手術(shù)組只開胸?cái)D出心臟后穿縫合線，但不結(jié)扎。術(shù)后分別于6 h、24 h及6 d取材，梗死組和假手術(shù)組每個(gè)時(shí)間點(diǎn)3～4只，并將標(biāo)本放于液氮凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 Ccl2、Ccl5、Arg-1、IL-10mRNA 表達(dá)水平的測定 按照TRIZOLReagent說明書提取梗死區(qū)心肌組織總RNA，提取后的RNA用紫外分光光度計(jì)測定濃度和純度（OD260/280及260/230比值），瓊脂凝膠變性電泳鑒定RNA，然后反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，分裝，-70℃保存。按照FastStart Universal SYBR Green Master（ROX）試劑說明書進(jìn)行real-time PCR，主要如下：反應(yīng)體系為20μL，包括SYBR Green Master（ROX）10μL、5μmol/mL 的上、下游引物（序列詳見表1）各1μL、cDNA模板1μL、高壓超純水7μL；反應(yīng)條件：50℃ 2min，95℃10min，95℃15 s，60℃1min，共40個(gè)循環(huán)。設(shè)雙復(fù)孔，β-actin作為內(nèi)參。溶解曲線由PCR儀自動(dòng)生成。獲得心梗組和假手術(shù)組樣本中的目的基因及內(nèi)參基因的相對表達(dá)量，使用2-ΔΔCt方法比較兩組目的基因的表達(dá)情況，ΔΔCt=（Ct目的基因-Ct內(nèi)參基因）心梗組-（Ct目的基因-Ct內(nèi)參基因）假手術(shù)組。各組計(jì)算 2-ΔΔCt均數(shù)及標(biāo)準(zhǔn)差。

表 1 Ccl2、Ccl5、Arg-1、IL-10 和 β-actin 基因引物序列Tab 1 Nucleotide sequenceof specific primers for real-time PCR of Ccl2,Ccl5,Arg-1,IL-10 andβ-actin

2 結(jié)果

2.1 M1偏移標(biāo)志物Ccl2和Ccl5mRNA的表達(dá)水平 與假手術(shù)組相比，心肌梗死組Ccl2mRNA表達(dá)量在6 h開始增高，24 h達(dá)到高峰（分別是假手術(shù)組的2.3倍和4.29倍，P<0.05），6 d時(shí)表達(dá)水平下降（P>0.05）（圖1A）。而 Ccl5mRNA在6 h時(shí)與假手術(shù)組相比無明顯變化（P>0.05），24 h表達(dá)水平明顯升高，達(dá)到假手術(shù)組的2倍（P<0.05），6 d時(shí)下降（圖1B）。

2.2 M2偏移的標(biāo)志物Arg-1和IL-10mRNA的表達(dá)水平 與假手術(shù)組相比，Arg-1和IL-10的表達(dá)水平在24 h和6 d明顯升高。Arg-1在24 h較假手術(shù)組升高了14.5倍，并持續(xù)升高至6 d（P<0.05）；IL-10在24 h和6 d分別較假手術(shù)組升高了10.3倍和 2.9倍（P<0.05）（圖 2A-B）。

圖1 巨噬細(xì)胞M 1偏移相關(guān)標(biāo)志物Ccl2和Ccl5的動(dòng)態(tài)表達(dá)情況Fig 1 The dynam icmRNA expression of Ccl2 and Ccl5 for M 1 macrophage

圖2 巨噬細(xì)胞M 2偏移相關(guān)標(biāo)志物Arg-1和IL-10的動(dòng)態(tài)表達(dá)情況Fig 2 Thedynam icm RNA expression of Arg-1 and IL-10 for M 2 m acrophage

3 討論

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：在AMI6 h時(shí)，代表M1型巨噬細(xì)胞的炎癥因子Ccl2和Ccl5表達(dá)水平升高，24 h時(shí)達(dá)到峰值，6 d左右回落。而代表M2型巨噬細(xì)胞的細(xì)胞因子Arg-1和IL-10在心肌梗死后24 h至6 d左右的時(shí)間窗內(nèi)表達(dá)量升高。由此可以看出心肌梗死后不同表型的巨噬細(xì)胞浸潤心肌組織的時(shí)間序貫性：前期主要是M1型巨噬細(xì)胞浸潤，后期則是M2型發(fā)揮作用。

巨噬細(xì)胞在AMI后的病理學(xué)變化階段中發(fā)揮著不可或缺的作用[13]。在心肌細(xì)胞壞死數(shù)小時(shí)內(nèi)，巨噬細(xì)胞滲入梗死心肌區(qū)，行使復(fù)雜的修復(fù)功能[14-15]。研究者在小鼠心梗模型[1-2]中發(fā)現(xiàn)：小鼠心梗1～3 d內(nèi)梗死區(qū)有Ly-6Chi型單核細(xì)胞（對應(yīng)人類的M1型巨噬細(xì)胞）浸潤，4～6 d時(shí)心梗區(qū)浸潤的單核細(xì)胞為Ly-6Clow表型（對應(yīng)人類的M2型巨噬細(xì)胞）。同時(shí)還證實(shí)Ly-6Chi型單核細(xì)胞是促炎癥細(xì)胞，幫助清除細(xì)胞碎片，加劇細(xì)胞破壞胞外基質(zhì)。而Ly-6Clow型單核細(xì)胞能夠抑制炎癥反應(yīng)，促進(jìn)心肌細(xì)胞外基質(zhì)再生和血管新生。因此我們可以推斷參與心肌修復(fù)的單核巨噬細(xì)胞隨時(shí)間變化會(huì)發(fā)生表型偏移，同時(shí)發(fā)揮著相輔相成的心肌修復(fù)功能。通過對M1、M2型巨噬細(xì)胞生物標(biāo)志物動(dòng)態(tài)表達(dá)水平的檢測，本文第一次在基因水平上佐證了兩型細(xì)胞在心肌梗死后能夠有序地浸潤梗死區(qū)組織。

認(rèn)識心梗后巨噬細(xì)胞表型的偏移規(guī)律對心肌梗死的臨床治療學(xué)具有潛在指導(dǎo)意義。AMI后大多伴隨心室重塑。即使及時(shí)開通冠狀動(dòng)脈罪犯血管，某些AMI患者也會(huì)發(fā)生心力衰竭。這與過度的炎癥反應(yīng)之間存在一定聯(lián)系。過度炎癥反應(yīng)會(huì)加重組織損傷，延緩組織修復(fù)，促使左心室擴(kuò)張變形以致發(fā)生心力衰竭。因此，如能在心肌梗死初期適度控制M1型巨噬細(xì)胞活性，或者促使巨噬細(xì)胞由M1表型向M2型轉(zhuǎn)化將有助于改善心梗預(yù)后。

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