Midkine反義寡聚脫氧核苷酸對(duì)糖尿病腎病大鼠腎臟CTGF表達(dá)水平的影響

王俊偉，張麗梅，楊 慧，苑記清，任曉軍，馮 憑

（1.天津醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院代謝病科，天津300052；2.天津醫(yī)科大學(xué)解剖學(xué)教研室，天津 300070）

近年研究表明炎癥因子在糖尿病腎病（diabetic nephropathy,DN）的進(jìn)展中起到至關(guān)重要的作用，其中結(jié)締組織生長(zhǎng)因子（connective tissue growth factor,CTGF）是促進(jìn)腎臟纖維化的重要炎癥因子，另有最新研究發(fā)現(xiàn)[1]基因敲除中期因子（midkine,MK）的小鼠能顯著改善DN的進(jìn)展。MK是一種肝素結(jié)合細(xì)胞因子，具有趨化炎癥細(xì)胞，抗損傷和抗細(xì)胞凋亡等功能。既往對(duì)MK的研究?jī)H局限于腫瘤、神經(jīng)系統(tǒng)及炎癥性疾病，但在DN中的作用少有報(bào)道，MK與CTGF是否存在聯(lián)系尚不明確。本研究通過(guò)反義寡聚脫氧核苷酸（antisense oligodeoxynucleortides,AS-ODNs）技術(shù)抑制MK的合成，觀察MK對(duì)早期DN大鼠腎臟CTGF表達(dá)水平的影響，探討MK ASODNs在早期DN中的治療前景。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 采用8周齡、雄性清潔級(jí)SD大鼠，體重（197±18）g，購(gòu)自中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射醫(yī)學(xué)研究所，飼養(yǎng)于天津醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心。

1.2 實(shí)驗(yàn)材料 鏈脲佐菌素（STZ）購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；全程硫代磷酸化修飾的MKAS-ODNs購(gòu)自上海生工生物公司，序列如下5′-AGGGCGAGAAGGAAGAAG-3′[2]；RNA離心柱型試劑盒購(gòu)自北京百泰克公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自北京全式金公司；RealtimePCRMasterMix（SYBRGreen）購(gòu)自大連寶生物公司；實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物購(gòu)自北京奧科鼎盛公司。

1.3 方法 雄性清潔級(jí)SD大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后完全隨機(jī)法分為正常組、DN組和MKAS-ODNs組各20只。DN組和MKAS-ODNs組均行單側(cè)腎臟切除術(shù)，高糖高脂飼料飼養(yǎng)4周，隨后尾靜脈注射STZ 30mg/kg；正常組行切皮假手術(shù)，普通飼料飼養(yǎng)4周，尾靜脈注射檸檬酸緩沖液30mg/kg。注射STZ1周采用葡萄糖氧化酶法連續(xù)監(jiān)測(cè)3d隨機(jī)血糖均≥16.7mmol/L作為糖尿病造模成功的標(biāo)準(zhǔn)。分別于成模后第0、3、6周監(jiān)測(cè)飲水量、尿量、體重及24h尿微量白蛋白的變化，成模第6周末，MKAS-ODNs組尾靜脈注射MKAS-ODNs1mg/kg[2]，正常組和DN組予等量生理鹽水，干預(yù)4d后留取24h尿及腎臟組織待測(cè)。

1.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 離心柱法提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，采用SYBRGreen嵌合熒光技術(shù)進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量 PCR。引物：MK-up:5′-TTCTAGCCCTTGTTGCCTTCTT-3′;MK-down:5′-ACCCATGCCGCATCCTT-3′；CTGF-up:5′-CGGGAAATGCTGTGAGGA-3′；CTGF-down：5′-TCTGGACCAG GCAGTGG-3′；GAPDH-up：5′-GTCGGTGTGAACGGATTT-3′；GAPDH-down:5′-ACTCCACGACGTAC TCAGC-3′。反應(yīng)條件：預(yù)變性：95.0 ℃ 3min；變性：95.0 ℃ 10s；退火：56.7 ℃ 10s；延伸：72.0 ℃ 20s；39個(gè)循環(huán)；每個(gè)樣本重復(fù)3遍。儀器自動(dòng)生成CT值，GAPDH作為內(nèi)參基因?qū)颖具M(jìn)行校對(duì)，然后對(duì)不同組樣本間的目的基因表達(dá)量進(jìn)行比較，采用2-△CT 法計(jì)算。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 數(shù)據(jù)應(yīng)用統(tǒng)計(jì)分析軟件SPSS 18.0處理，采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間均數(shù)比較采用單因數(shù)方差分析（ANOVA），組內(nèi)兩兩比較采用LSD，Dunnett’s法，并進(jìn)行 speraman 相關(guān)分析。統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性檢驗(yàn)水平α=0.05（雙側(cè)）。

2 結(jié)果

2.1 一般指標(biāo) 成模后DN組和MKAS-ODNs組大鼠逐漸出現(xiàn)多飲、多尿、體重下降，毛發(fā)枯黃，精神體力差等糖尿病癥狀。于第6周開(kāi)始出現(xiàn)24h尿微量白蛋白升高且與正常組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，此時(shí)糖尿病大鼠處于早期DN階段。處死后DN組和MKAS-ODNs組大鼠腎臟體積增大，重量增加，髓質(zhì)部分空虛，測(cè)腎重體重比值較正常組明顯增加，進(jìn)一步證明糖尿病大鼠處于早期DN階段（表1）。

表1 糖尿病大鼠成模后第0、3、6周時(shí)的相關(guān)指標(biāo)變化Tab1 Diabe ticrats after0,3,6week sinto the mold when the changesi nrelevantin dicators（ ）

表1 糖尿病大鼠成模后第0、3、6周時(shí)的相關(guān)指標(biāo)變化Tab1 Diabe ticrats after0,3,6week sinto the mold when the changesi nrelevantin dicators（ ）

3周417.56±75.33 396.08±52.24 410.69±65.58 1.010 0.398 0周358.17±60.96 434.75±37.84 424.15±47.12 6.663 0.001 0周35.17±10.34 34.65±35.85 24.15±27.12 6.663 0.001 6周494.67±78.87 409.67±56.50 462.91±72.44 4.812 0.006 3周28.67±14.58 152.50±86.96 110.00±67.55 5.673 0.002 6周56.67±88.24 227.90±101.48 119.10±90.07 9.937 0.000 0周0.11±0.04 0.12±0.05 0.15±0.02 0.95 0.960 3周0.09±0.03 1.36±1.49 1.79±1.96 1.010 0.398 6周1.90±1.03 16.61±12.56 17.32±2.85 4.812 0.006體重/kg 尿量/mL 24h尿微量白蛋白/(mmol/L) 腎重體重比值2.6±0.23 8.5±1.43 7.56±0.63 2.562 0.021 n組別20 20 20正常組DN組MKAS-ODNs組FP

2.2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果 DN組大鼠腎臟組織中MK和CTGF的表達(dá)水平較正常組明顯增多，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；MKAS-ODNs組大鼠腎臟組織中MK和CTGF的表達(dá)水平較DN組明顯減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）（表 2）。

表2 各組MK和CTGF表達(dá)水平的比較Tab2 Comparison with theexpressionlevel of MKandCTGFin eachgroup（ ）

表2 各組MK和CTGF表達(dá)水平的比較Tab2 Comparison with theexpressionlevel of MKandCTGFin eachgroup（ ）

與正常組比較#P<0.05；與DN組比較*P<0.05，**P<0.01

組別正常組DN組MKAS-ODNs組FP CTGF/（×103）0.74±0.54 216.14±143.98#0.31±0.23**16.98 0.000 MK/（×103）0.23±0.13 235.95±165.01#0.48±0.29*12.35 0.000 n 10 10 10

2.3 MK和CTGF在DN大鼠腎臟組織表達(dá)的相關(guān)性 MK和CTGF在DN大鼠腎臟組織的表達(dá)有直線相關(guān)關(guān)系，且為正相關(guān)（r=0.498，P<0.05）。

3 討論

炎癥因子與糖尿病腎病的進(jìn)展密切相關(guān)，其中CTGF不僅是促進(jìn)腎小管上皮細(xì)胞間質(zhì)化的重要因子，還對(duì)細(xì)胞外基質(zhì)的產(chǎn)生、積聚起重要作用[3]，是促進(jìn)DN進(jìn)展的重要細(xì)胞因子。既往有研究發(fā)現(xiàn)CTGFAS-ODNs可以有效地抑制大鼠腎間質(zhì)纖維化，抑制腎小管上皮細(xì)胞間質(zhì)化[4]。但是CTGF在體內(nèi)多個(gè)臟器均表達(dá)，若應(yīng)用反義寡聚脫氧核苷酸抑制CTGF的表達(dá)必定會(huì)影響其他臟器，而MK在成年組織中僅于腎臟和小腸表達(dá)，其他部位幾乎不表達(dá)[5-6]。最新研究發(fā)現(xiàn)MK的表達(dá)水平和DN的進(jìn)展呈正相關(guān)[7]，但MK與CTGF的相關(guān)性尚不明確。本研究通過(guò)反義寡聚脫氧核苷酸技術(shù)抑制MK的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)減少M(fèi)K合成可以有效地抑制CTGF的表達(dá)。

目前，反義寡聚脫氧核苷酸技術(shù)已經(jīng)被廣泛應(yīng)用。本研究將MK作為反義治療的靶點(diǎn)，首先考慮到MK基因生理情況下的表達(dá)特點(diǎn)：MK在胚胎上皮-間葉組織和神經(jīng)組織中呈高表達(dá)，出生后MK基因的表達(dá)逐漸降低；在成年組織中，除腎臟和小腸上皮外其他部位幾乎不表達(dá)。因此，筆者認(rèn)為將MK作為治療的靶點(diǎn)所導(dǎo)致的副作用最小。其次，有文獻(xiàn)報(bào)道MK AS-ODNs在尾靜脈注射后可快速地被大鼠近端小管選擇性攝取并整合到近端腎小管上皮細(xì)胞中[8]，近端小管上皮細(xì)胞通過(guò)刷狀緣膜ODNs結(jié)合蛋白的活動(dòng)可以不衰減地有效地?cái)z取ODNs[9-11]，本研究證實(shí)早期DN大鼠腎臟組織中MK的表達(dá)水平明顯高于正常組，當(dāng)予MK AS-ODNs干預(yù)4 d后MK的合成較DN組明顯減少，說(shuō)明通過(guò)尾靜脈注射的方法可以成功地將MK AS-ODNs導(dǎo)入腎臟組織并發(fā)揮作用，與國(guó)外報(bào)道一致。

本研究發(fā)現(xiàn)MK和CTGF的表達(dá)水平呈正相關(guān)，CTGF在早期DN大鼠腎臟組織中的表達(dá)水平隨著MK表達(dá)的減少而減少，說(shuō)明MK AS-ODNs通過(guò)抑制MK的合成，可以降低早期DN大鼠腎臟組織CTGF的表達(dá)水平，從而阻斷腎間質(zhì)纖維化的進(jìn)程、抵抗腎間質(zhì)損傷，對(duì)于早期DN具有治療潛能。

總之，尾靜脈注射MK AS-ODNs可以降低早期DN大鼠腎臟組織MK和CTGF的表達(dá)水平，減緩腎間質(zhì)纖維化進(jìn)程且安全性高、副作用小。因此，我們認(rèn)為MK AS-ODNs有望成為治療DN的新靶點(diǎn)。

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