柴胡疏肝散對(duì)慢性胰腺炎大鼠肝臟核因子-κB活性的干預(yù)

周曉磊，尤勝義

（天津醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院中西醫(yī)結(jié)合外科，天津 300052）

柴胡疏肝散出自《景岳全書》，主治肝郁氣滯證，方中用柴胡疏肝解郁為君藥。香附理氣疏肝，同時(shí)可行氣活血而止痛，助柴胡以解開(kāi)經(jīng)之郁滯，為臣藥。陳皮、枳殼理氣行滯；芍藥、甘草養(yǎng)血柔肝，緩急止痛，為佐藥。甘草兼調(diào)諸藥，亦為使藥之用。諸藥相合，發(fā)揮疏肝解郁、理氣止痛功效。慢性胰腺炎(chronic pancreatitis,CP)的中醫(yī)辨證主要表現(xiàn)為肝郁氣滯為主的實(shí)熱或濕熱郁結(jié)，因此臨床上應(yīng)用柴胡疏肝散治療CP取得了較好療效，現(xiàn)代藥理學(xué)證明其治療機(jī)制可能與抗炎、保肝、清除氧自由基及改善微循環(huán)等作用有關(guān)。糖代謝障礙作為CP的主要并發(fā)癥之一，近年來(lái)開(kāi)始受到各國(guó)學(xué)者的關(guān)注。由于發(fā)病機(jī)制不清，控制CP患者的血糖成為一項(xiàng)世界性難題。深入研究發(fā)現(xiàn)CP患者及動(dòng)物模型存在明顯的肝臟胰島素抵抗，即胰島素抑制肝臟糖異生和糖原分解的作用減弱，是導(dǎo)致機(jī)體糖代謝障礙的重要致病因素[1]。本研究旨在觀察中藥柴胡疏肝散對(duì)CP引發(fā)的大鼠肝臟胰島素抵抗的干預(yù)作用，并探討其機(jī)制，為臨床治療CP患者糖代謝障礙提供理論指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 清潔級(jí)雌性Wistar大鼠40只，體重180～250 g，購(gòu)自中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射醫(yī)學(xué)研究所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心(許可證編號(hào)SCXK津2005-0001)，12 h日光燈照射維持晝夜循環(huán)。

1.2 主要試劑 99%油酸購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；柴胡疏肝散（柴胡6 g、陳皮6 g、川芎4.5 g、香附4.5 g、枳殼4.5 g、芍藥4.5 g、炙甘草1.5 g）由天津醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院制劑室煎制成濃度0.56 g/mL的水煎劑；核因子-κB（nuclear factor-κB,NF-κB）p65兔抗大鼠單克隆抗體購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司；辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記羊抗兔IgG購(gòu)自美國(guó)Bioworld公司；SABC免疫組化試劑盒購(gòu)自武漢博士德公司。

1.3 動(dòng)物分組及干預(yù) 大鼠隨機(jī)分為模型組、對(duì)照組、中藥低劑量治療組和高劑量治療組，每組10只。模型組和兩治療組大鼠采用油酸胰膽管注射的方法建立CP模型，切取胰腺組織行病理學(xué)檢查確證模型成功[2-3]；對(duì)照組僅打開(kāi)腹腔輕度翻轉(zhuǎn)胰腺后關(guān)腹。6周后低劑量和高劑量組大鼠，分別每日每只給予柴胡疏肝散水煎劑1.4 g/kg和2.8 g/kg體重灌胃，模型組與對(duì)照組大鼠給予等量蒸餾水灌胃，共4周。整個(gè)實(shí)驗(yàn)持續(xù)10周。

1.4 口服葡萄糖耐量實(shí)驗(yàn)（oral glucose tolerance test,OGTT） 給藥后4周，大鼠禁食16 h，按2 g/kg劑量將預(yù)先配制好的1.11mmol/L無(wú)菌葡萄糖溶液灌胃，尾靜脈取血，微量血糖儀測(cè)定各組大鼠0、30、60、120min和180min血糖值，根據(jù)公式計(jì)算OGTT曲線下血糖面積（areaunder curve,AUC）[4]，AUC 越大代表糖耐量受損越嚴(yán)重。

1.5 胰島素耐量實(shí)驗(yàn)（insulin tolerance test,ITT） 給藥后4周，各組大鼠按0.75 IU/kg的人胰島素注射，于注射后0、30、60、120min尾靜脈取血微量血糖儀測(cè)定血糖，根據(jù)公式計(jì)算胰島素刺激下的葡萄糖下降率 （glucose disappearance rate,KITT）[5]，KITT值降低提示胰島素敏感性降低。

1.6 肝細(xì)胞分離和葡萄糖釋放實(shí)驗(yàn) 兩步膠原酶灌注法分離肝細(xì)胞[6-8]，臺(tái)盼藍(lán)排斥實(shí)驗(yàn)評(píng)估肝細(xì)胞活力。將分離獲得的肝細(xì)胞用含5mmol/L乳酸鈉和0.5mmol/L丙酮酸鈉的DMEM培養(yǎng)基調(diào)成1×106個(gè)細(xì)胞/mL的細(xì)胞懸液。培養(yǎng)基中不加胰島素的作為基礎(chǔ)組，其余加入1nmol/L胰島素的作為胰島素組。然后置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)孵育1 h，吸取上清液利用全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定葡萄糖濃度，同批次內(nèi)重復(fù)測(cè)定3次。離心管中剩余部分BCA法進(jìn)行蛋白定量。最后將葡萄糖濃度用蛋白濃度進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，用μmol/（g蛋白·h）表示。

1.7 免疫組化法檢測(cè)肝臟NF-κB活化水平 利用鏈霉親合素-生物素-過(guò)氧化物酶復(fù)合物(SABC)法檢測(cè)肝臟NF-κB p65活性。結(jié)果判定：細(xì)胞染色呈棕黃色為陽(yáng)性，定位于細(xì)胞核和細(xì)胞漿。陽(yáng)性率計(jì)算方法：取5個(gè)高倍視野計(jì)算陽(yáng)性細(xì)胞占總細(xì)胞數(shù)的百分率作為陽(yáng)性率。

1.8 統(tǒng)計(jì)處理 采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，計(jì)量資料均以表示，多個(gè)樣本均數(shù)間比較用單因素方差分析（oneway ANOVA），均數(shù)間兩兩比較用LSD檢驗(yàn)。以P<0.05為顯著性差異標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié)果

2.1 AUC值 將OGTT實(shí)驗(yàn)血糖值按公式計(jì)算AUC值，結(jié)果顯示：模型組AUC值顯著高于對(duì)照組（P<0.05)，兩個(gè)治療組與模型組比較AUC值均顯著降低（P<0.05)，而高劑量組AUC值顯著低于低劑量組（P<0.05）。各組AUC值結(jié)果見(jiàn)表1。

2.2 KITT值 將ITT實(shí)驗(yàn)血糖值按公式計(jì)算KITT值，結(jié)果顯示：模型組KITT值顯著低于對(duì)照組（P<0.05），兩個(gè)治療組與模型組比較KITT值均顯著升高（P<0.05)，而兩治療組之間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。各組KITT值結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 各組大鼠AUC和KITT結(jié)果Tab 1 AUC and K ITT value in each group

表1 各組大鼠AUC和KITT結(jié)果Tab 1 AUC and K ITT value in each group

與對(duì)照組比較*P<0.05;與模型組比較#P<0.05;與低劑量組比較△P<0.05

組別對(duì)照組模型組低劑量組高劑量組KITT/(%/min)8.36±1.66 2.34±0.91*5.78±1.85*#7.36±2.00#AUC/[mmol/(L·h)]13.86±1.18 23.25±2.74*19.35±1.51*#16.12±1.53#△n 10 10 10 10

2.3 肝細(xì)胞葡萄糖釋放濃度 在基礎(chǔ)條件下各組大鼠離體肝細(xì)胞的葡萄糖釋放濃度之間兩兩比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；在培養(yǎng)基含1 nmol/L胰島素的條件下，各組大鼠肝細(xì)胞的葡萄糖釋放與其在基礎(chǔ)條件下比較出現(xiàn)不同程度降低，其中對(duì)照組下降最明顯。各組培養(yǎng)基中葡萄糖濃度檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 各組肝細(xì)胞培養(yǎng)基葡萄糖檢測(cè)結(jié)果Tab 2 Glucose concentrations inm edium of isolated hepatocyte from each group

表2 各組肝細(xì)胞培養(yǎng)基葡萄糖檢測(cè)結(jié)果Tab 2 Glucose concentrations inm edium of isolated hepatocyte from each group

與對(duì)照組比較*P<0.05;與模型組比較#P<0.05

對(duì)照組模型組低劑量組高劑量組10 10 10 10胰島素組23.06±5.67 45.11±12.03*32.90±11.20#28.97±10.80#基礎(chǔ)組86.64±12.21 87.15±16.27 82.47±15.30 80.31±12.40葡萄糖[μmol/(g蛋白·h)]抑制率/%(基礎(chǔ)組-胰島素組)/基礎(chǔ)組×100%73.57±4.28 48.49±7.95*60.11±9.26*#63.93±8.21*#組別 n

2.4 免疫組化結(jié)果 對(duì)照組絕大多數(shù)細(xì)胞無(wú)明顯染色，極少數(shù)細(xì)胞有一定程度染色，主要在胞漿,見(jiàn)圖1A；模型組絕大多數(shù)細(xì)胞有強(qiáng)染色，且染色主要集中在胞核,見(jiàn)圖1B；兩個(gè)治療組有中等數(shù)量的細(xì)胞染色呈陽(yáng)性，胞漿和胞核均有一定程度著色，其中高劑量組的陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)較低劑量組更少，見(jiàn)圖1C和1D。各組大鼠肝臟NF-κB陽(yáng)性細(xì)胞率見(jiàn)表3。

圖1 各組肝臟NF-κB免疫組化圖（×200）Fig 1 Imm unohistochem istry for hepatic NF-κB expression in each group（×200）

表3 肝臟NF-κB陽(yáng)性細(xì)胞率Tab 3 Percentageof NF-κB-positive staining cells in hepatic cells

表3 肝臟NF-κB陽(yáng)性細(xì)胞率Tab 3 Percentageof NF-κB-positive staining cells in hepatic cells

與對(duì)照組比較*P<0.05;與模型組比較#P<0.05；與低劑量組比較△P<0.05

n 10 10 10 10組 別對(duì)照組模型組低劑量組高劑量組NF-κB陽(yáng)性細(xì)胞/%9.648±2.844 80.413±18.096*53.933±10.911*#42.313±9.295*#△

3 討論

隨著我國(guó)人民生活水平提高和飲食結(jié)構(gòu)改變，CP發(fā)病率逐年增加。文獻(xiàn)報(bào)道約1/3的CP患者繼發(fā)糖尿病，70%以上的患者存在糖耐量異常[9]，因此深入研究CP糖代謝障礙的發(fā)生機(jī)制、探索有效治療藥物對(duì)于改善患者的預(yù)后具有重要意義。肝臟內(nèi)生性糖的產(chǎn)生(hepatic glucose production,HGP)包括糖異生和糖原分解，受血清胰島素負(fù)性調(diào)節(jié)，維持機(jī)體正常的血糖水平[10-12]。國(guó)外有學(xué)者給CP患者輸注同位素標(biāo)記的葡萄糖后，利用正常血糖-高胰島素鉗夾技術(shù)檢測(cè)HGP，結(jié)果表明CP病理狀態(tài)下胰島素抑制HGP的能力減弱，即發(fā)生了肝臟胰島素抵抗[13]，這一發(fā)現(xiàn)使研究人員開(kāi)始關(guān)注肝臟胰島素抵抗在CP糖代謝障礙中的致病作用。本實(shí)驗(yàn)中，ITT結(jié)果顯示模型組大鼠KITT值顯著低于對(duì)照組 (P<0.05)，提示CP導(dǎo)致大鼠胰島素敏感性降低，即發(fā)生胰島素抵抗；同時(shí)大鼠肝細(xì)胞離體實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示在培養(yǎng)基含1 nmol/L胰島素的條件下，雖然各組大鼠肝細(xì)胞的葡萄糖釋放均受到不同程度地抑制，但模型組的抑制率僅為48.49%，與對(duì)照組73.57%的抑制率比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），這一結(jié)果提示CP大鼠肝細(xì)胞對(duì)胰島素的敏感性減低，與上述ITT活體實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致，進(jìn)一步證明肝臟胰島素抵抗是CP導(dǎo)致機(jī)體發(fā)生糖代謝障礙的一個(gè)重要機(jī)制。

傳統(tǒng)中醫(yī)理論認(rèn)為CP的病因多為長(zhǎng)期嗜酒、飲食不節(jié)、情志不暢，致使肝膽脾胃功能失調(diào)，而表現(xiàn)為肝郁氣滯，脾胃濕熱蘊(yùn)結(jié)為主的實(shí)熱或濕熱郁結(jié)。胰腺炎癥反復(fù)發(fā)作，久之肝胃郁熱，火炎于上，津液泄于下；肝之疏泄太過(guò)，腎之閉藏失司，則糖尿病“三多一少”癥狀隨之而起。柴胡疏肝散源于明·張介賓《景岳全書》，是在《傷寒論》四逆湯的基礎(chǔ)上去枳實(shí)加枳殼、陳皮、川芎、香附而成，具有疏肝解郁、理氣止痛功效，臨床常用于治療肝氣郁結(jié)證。本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用柴胡疏肝散治療4周后，OGTT顯示兩個(gè)治療組與模型組比較AUC值均顯著降低（P<0.05），而高劑量組AUC值顯著低于低劑量組（P<0.05），說(shuō)明應(yīng)用柴胡疏肝散治療CP大鼠的糖耐量異常療效確切，而且呈一定劑量依賴性。ITT和肝細(xì)胞釋放實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示兩治療組較模型組大鼠的KITT值和胰島素對(duì)離體肝細(xì)胞葡萄糖釋放的抑制率均顯著升高（P<0.05），說(shuō)明柴胡疏肝散治療CP糖代謝障礙與改善肝臟胰島素抵抗有關(guān)。

目前普遍認(rèn)為胰島素抵抗是一種慢性非特異性炎癥過(guò)程，受NF-κB活性調(diào)控的許多炎性介質(zhì)如腫瘤壞死因子-α、白介素-1β等均能誘發(fā)胰島素抵抗。國(guó)內(nèi)外研究均已證實(shí)下調(diào)NF-κB的活性能使肝臟和脂肪等組織的胰島素敏感性增加，而上調(diào)NF-κB的活性能誘導(dǎo)這些組織發(fā)生胰島素抵抗[14-15]。我們?cè)谝酝难芯恐袘?yīng)用Western blot檢測(cè)了CP大鼠肝臟的NF-κBp65蛋白表達(dá)，結(jié)果顯示模型組肝組織NF-κBp65蛋白表達(dá)較對(duì)照組明顯升高（P<0.05）[16]。而本實(shí)驗(yàn)中肝臟免疫組化的結(jié)果顯示模型組肝臟NF-κBp65陽(yáng)性細(xì)胞率較對(duì)照組顯著增高（P<0.05），與 Western blot結(jié)果一致，說(shuō)明上調(diào)肝臟NF-κB活性可能是CP引發(fā)肝臟胰島素抵抗的機(jī)制之一。此外，兩治療組肝臟NF-κBp65陽(yáng)性細(xì)胞率較模型組均顯著降低（P<0.05），表明柴胡疏肝散通過(guò)抑制肝臟NF-κB的過(guò)度活化，進(jìn)而改善CP引發(fā)的肝臟胰島素抵抗，治療糖代謝障礙。本實(shí)驗(yàn)豐富了中西醫(yī)結(jié)合學(xué)科的內(nèi)涵，為探索新型的針對(duì)CP患者的降糖藥物開(kāi)拓了新思路，對(duì)于改善CP患者的預(yù)后具有潛在應(yīng)用價(jià)值。

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