不同時間缺氧對脂肪細胞炎癥因子表達的影響

胡立娟，牛文彥

（天津醫(yī)科大學免疫學教研室，天津300070）

肥胖患者脂肪組織過度肥大，且先于血管生成造成局部脂肪組織缺氧，因此脂肪細胞處于慢性缺氧狀態(tài)。肥胖的脂肪組織伴有巨噬細胞浸潤，脂肪細胞自身及浸潤的巨噬細胞可釋放大量炎癥因子，如白細胞介素-1（IL-1）、白細胞介素-6（IL-6）、單核細胞趨化因子（MCP）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）等[1]，因此肥胖可視為一種慢性炎癥。慢性炎癥已成為2型糖尿病發(fā)病病因主要學說。最近有研究認為缺氧是造成脂肪組織慢性炎癥的因素，本研究用1%O2、5%CO2、94%N2孵育脂肪細胞不同時間，檢測脂肪細胞表達的炎癥因子水平的變化。

1 材料與方法

1.1 材料 3T3-L1脂肪細胞株 (由加拿大Amira Klip教授提供)，Hanks液、DMEM高糖（天潤善達公司），胎牛血清（以色列 Bioind公司），胰島素、1-甲基-3-異丁基-黃嘌呤（IBMX）、地塞米松溶液（美國Sigma公司），偶聯(lián)HRP的山羊抗兔抗體（美國Jackson Immuno Research公司），增強化學發(fā)光底物檢測試劑盒（美國PerkinElmer公司），高純總RNA提取試劑盒（北京百泰克公司）、cDNA合成試劑盒（北京天根公司）、Premix ExTaq酶、TaqDNA聚合酶、dNTPMixture、熒光實時定量PCR試劑盒（Takara寶生物工程公司），引物合成（北京奧科生物技術公司）。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) 3T3-L1前脂肪細胞用含有10%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)基，在37℃5%CO2條件下培養(yǎng)至融合達80%，按密度為5×104/mL將細胞接種在培養(yǎng)板中，待生長至完全融合后再生長2 d進行誘導分化，以下誘導分化培養(yǎng)基均用高糖DMEM培養(yǎng)基配制，用含0.5mmol/L IBMX、lμmol/L地塞米松、5mg/L胰島素的誘導分化培養(yǎng)基培養(yǎng)2 d，再用含5mg/L胰島素的誘導分化培養(yǎng)基培養(yǎng)2 d，之后每2 d換含有10%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)基1次，約第14天達到90%以上為成熟脂肪細胞，此時細胞中出現(xiàn)串狀的脂肪滴。將細胞分為常氧組37℃1%O 5%CO 94%N2下孵育時間為4、8和16 h。

1.2.2 免疫印跡檢測葡萄糖轉運子1（GLUT1）的表達 常氧或缺氧培養(yǎng)脂肪細胞后，裂解細胞，測蛋白后取40μg裂解液，65℃加熱15min，7.5%(v/v)SDS-PAGE電泳，免疫印跡檢測GLUT1，一抗用抗GLUT1的兔抗體，二抗用偶聯(lián)HRP的山羊抗兔抗體，以Actinin1作內參，增強化學發(fā)光底物試劑盒檢測，曝光，應用NIH Image J軟件分析定量。

1.2.3 Real-time PCR法測定脂肪細胞 TNF-α、MCP-1mRNA水平 提取總RNA，取2μg合成cDNA第一鏈，取2μg cDNA產(chǎn)物及相應上下游引物加入 12.5μLSYBR誖PremixEx Taq TM(2×)體系內擴增，條件為 95 ℃ 30 s，95 ℃ 5 s，57 ℃ 10 s，72 ℃34 s，40個循環(huán)，β-actin為內參。TNF-α 上游引物為5′-CGTCGTAGCAAACCACCAA-3′；下游引物為 5′-GAGAACCTGGGAGTAGACAAGG-3′。MCP-1 上游引物為 5′-GCAGTTAACGCCCCACTCA-3′，下游引物為 5′-CCCAGCCTACTCATTGGGATCA-3′。β-actin上游引物為 5′-GGCTGTATTCCCCTCCATCG-3′；下游引物為 5′-CCAGTTGGTAACAATGCCATGT-3′。

1.3 統(tǒng)計學處理 采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件包進行統(tǒng)計學分析。所有實驗數(shù)據(jù)均以平均值±標準差表示，組間比較采用單因素方差分析（One-Way ANOVA），兩組之間比較采用t檢驗，以P<0.05認為有統(tǒng)計意義。

2 結果

2.1 缺氧脂肪細胞GLUT1的表達 與常氧培養(yǎng)組相比，脂肪細胞不同時間缺氧培養(yǎng)后缺氧應答基因GLUT1蛋白表達升高，4 h缺氧組為常氧組的（2.10±0.20）倍，8 h 缺氧組為常氧組的（4.20±0.30）倍，16 h缺氧組為常氧組的（5.57±0.68）倍，表明缺氧培養(yǎng)成功，見圖1。

圖1 不同時間缺氧培養(yǎng)脂肪細胞后GLUT1的表達Fig 1 Different incubation timeof hypoxia on theexp resion of GLUT1 in adipocytes

2.2 脂肪細胞TNF-α、MCP-1mRNA的表達 與常氧培養(yǎng)組相比，缺氧培養(yǎng)的脂肪細胞TNF-α mRNA表達升高，并且隨著缺氧時間的延長而升高，4 h缺氧組為常氧組的（1.88±0.23）倍，8 h缺氧組為常氧組的（2.34±0.26）倍，16 h缺氧組為常氧組的（3.54±0.0.94）倍，不同時間的缺氧組與常氧組相比差異均有統(tǒng)計學意義（P=0.002）。其中8 h缺氧組與4 h缺氧組相比，TNF-αmRNA表達升高，但差異卻無統(tǒng)計學意義（P=0.296），16 h缺氧組與4 h缺氧組相比，TNF-αmRNA表達明顯升高，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05），16 h缺氧組與8 h缺氧組相比，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05），見圖2。缺氧脂肪細胞比常氧脂肪細胞MCP-1mRNA表達升高，4 h缺氧組為常氧組的（2.24±0.52）倍，8 h缺氧組為常氧組的（2.43±0.35）倍，16 h缺氧組為常氧組的（3.66±0.77）倍，不同時間的缺氧組與常氧組相比差異均有統(tǒng)計學意義（P=0.016）。其中8 h缺氧組與4 h缺氧組相比MCP-1mRNA表達無差異，16 h缺氧組與4 h缺氧組相比，MCP-1mRNA表達明顯升高，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.01），16 h缺氧組與8 h缺氧組相比，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05），見圖3。

圖2 不同時間缺氧孵育后脂肪細胞TNF-α的基因表達Fig 2 Different incubation tim eof hypoxia on theexpresion of TNF-αin adipocytes

圖3 不同時間缺氧孵育后脂肪細胞MCP-1的基因表達Fig3 Different incubation tim eof hypoxia on theexpresion of MCP-1 in adipocytes

3 討論

肥胖是一種慢性低度炎癥，與糖尿病、動脈粥樣硬化、高胰島素血癥、心血管疾病等密切相關。肥胖相關性炎癥的發(fā)生與血清中炎癥因子，包括脂肪因子的異常密切相關。新近發(fā)現(xiàn)在肥胖小鼠的脂肪組織中存在局部缺氧和巨噬細胞浸潤增加，并且與炎癥因子的升高密切相關[2]。脂肪組織內脂肪細胞及定居在其中的巨噬細胞分泌的IL-1、IL-6、MCP-1、TNF-α等炎癥因子釋放入血液可影響胰島素在其它靶組織中的作用。本研究用1%O2孵育脂肪細胞不同時間，造成脂肪細胞缺氧，研究缺氧孵育不同時間后脂肪細胞表達炎癥因子的變化。

GLUT1為基礎狀態(tài)下攝取葡萄糖的主要轉運子，缺氧狀態(tài)下表達增高[3]。本研究通過檢測GLUT1蛋白的表達變化，驗證缺氧處理的效果。缺氧4 h GLUT1蛋白的表達較常氧組明顯升高，并且缺氧時間越長，升高越明顯，表明造成缺氧模型。肥胖動物的脂肪組織在增長的過程中，肥大的脂肪細胞的氧供應相對減少，導致脂肪細胞缺氧。在肥胖小鼠的脂肪組織，炎癥因子（TNF-α、IL-1、IL-6等）和巨噬細胞標志分子的基因表達增加，同時伴有缺氧反應基因的增加，說明在肥胖小鼠的脂肪組織中存在慢性炎癥且與缺氧有關。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)缺氧孵育4 h的脂肪細胞與常氧培養(yǎng)的脂肪細胞相比，游離脂肪酸（FFA）、TNF-α、MCP-1、IL-6明顯升高，脂聯(lián)素降低，證明缺氧導致脂肪細胞的炎癥發(fā)生。炎癥引起脂肪細胞自身胰島素抵抗，分泌FFA和多種炎癥因子，進而影響其它胰島素靶組織骨骼肌和肝臟的胰島素敏感性，造成周身胰島素抵抗（insulin resistance，IR），最終導致2型糖尿病。因為缺氧造成的是慢性炎癥，因此本研究延長缺氧時間，檢測長時間的缺氧對脂肪細胞炎癥因子的影響。

TNF-α是具有多種生物活性的細胞因子，適量的TNF-α能殺傷和抑制腫瘤細胞，促進中性粒細胞吞噬，抗感染，促進細胞增殖和分化等，是機體免疫防護的重要介質，對機體有利；而過量的TNF-α與其他炎癥因子一起產(chǎn)生多種病理損傷，脂源性和肌源性的TNF-α在肥胖所致外周胰島素抵抗的病理過程中起重要作用[4]。肥胖、胰島素抵抗的動物脂肪組織TNF-α增高，中和TNF-α后，可以逆轉動物的胰島素抵抗[5]。研究表明，伴IR的肥胖個體脂肪組織TNF-αmRNA表達及TNF-α分泌均增加，且與空腹血漿胰島素水平及體重指數(shù)呈正相關[6-7]，當體重下降時，其表達水平隨之下降。本研究發(fā)現(xiàn)缺氧處理的脂肪細胞TNF-α水平明顯升高，并且缺氧時間越長，升高越明顯，說明長時間缺氧比短時間缺氧造成脂肪細胞更嚴重的炎性反應。

單核細胞趨化因子MCP-1在招募單核細胞和T淋巴細胞中發(fā)揮關鍵作用。在飲食導致的肥胖早期MCP-1表達增加，因此MCP-1被認為是招募巨噬細胞進入脂肪組織的因子。高脂喂養(yǎng)MCP-1缺陷小鼠，脂肪組織的巨噬細胞浸潤在一定程度上部分減少，并且胰島素敏感性得到改善[8]。本課題組已往的研究發(fā)現(xiàn)缺氧培養(yǎng)4 h的脂肪細胞條件培養(yǎng)基比常氧的脂肪細胞條件培養(yǎng)基造成更嚴重的骨骼肌胰島素抵抗，并吸引更多的巨噬細胞浸潤[9]。本研究在此基礎之上，延長缺氧孵育時間，發(fā)現(xiàn)16 h缺氧孵育的脂肪細胞MCP-1表達增加比4 h、8 h的升高更加明顯，與TNF-α表達水平相一致，因此筆者推測，長時間的缺氧可引起脂肪細胞條件培養(yǎng)基含有更多的炎性因子。后續(xù)研究將延長缺氧孵育脂肪細胞時間，收集條件培養(yǎng)基，檢測該條件培養(yǎng)基是否造成更嚴重的骨骼肌細胞胰島素抵抗。

綜上所述，缺氧處理的脂肪細胞比常氧條件下的脂肪細胞TNF-α和MCP-1的表達升高，并且缺氧時間越長，升高越明顯。

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