補充磷脂對大鼠腓腸肌鈍挫傷后腓腸肌氧自由基反應(yīng)和脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的影響

周 靜,董義俊,葛新發(fā),李可峰,陳京來,董貴俊

(1.中國石油大學(xué)體育教學(xué)部,山東 青島 266555;2.47師預(yù)備役坦克團(tuán),吉林 四平 136500;3.山東體育學(xué)院,山東 濟(jì)南250102)

鈍挫傷是一種常見的運動損傷,在不同運動項目中占有很高的比例.在對抗性項目或者意外事故中,鈍挫傷具有更高的發(fā)生幾率,這通常會嚴(yán)重影響傷者的運動能力及運動壽命.鈍挫傷后,由于肌肉自身恢復(fù)速度較慢,且容易生成疤痕組織,因此如何預(yù)防疤痕組織生成,加快骨骼肌損傷修復(fù)的速度,一直是運動醫(yī)學(xué)領(lǐng)域研究熱點之一[1].鈍挫傷早期,細(xì)胞膜通透性增加,炎性細(xì)胞浸潤導(dǎo)致大量氧自由基生成,容易加重?fù)p傷的程度,如何防范鈍挫傷后自由基的產(chǎn)生是促進(jìn)肌纖維再生的關(guān)鍵[2-4].磷脂作為細(xì)胞膜系統(tǒng)的基本成分,對生物膜的流動性、通透性和完整性起著重要的作用.補充磷脂可以增加細(xì)胞膜的流動性、韌性和變形能力,增強細(xì)胞膜的功能.因而,磷脂補充可能益于修復(fù)細(xì)胞膜損傷,加速鈍挫傷后損傷修復(fù)程度[5-6].

本研究通過對重物自由落體誘發(fā)的腓腸肌鈍挫傷后恢復(fù)過程的大鼠補充外源性磷脂,觀察鈍挫傷后12 h、24 h、2 d、10 d、17 d、30 d 后大鼠骨骼肌超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)活性及丙二醛(MDA)含量變化,探討補充磷脂后對大鼠鈍挫傷腓腸肌中氧自由基反應(yīng)和脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的影響.

1 材料與方法

1.1 動物分組及喂養(yǎng)方法

實驗動物采用雄性wistar大鼠132只,購自山大動物中心提供,體重140-160 g,分籠飼養(yǎng),自由進(jìn)食、飲水,適應(yīng)性喂養(yǎng)3天,飼養(yǎng)條件為室溫(24±2)℃,相對濕度控制在(55±15)%.大豆磷脂飼料,由基礎(chǔ)飼料+10%大豆粉末磷脂(購自北京美亞斯磷脂技術(shù)有限公司)配制而成.隨機(jī)分四組,除安靜對照組6只外,其余每組42只.具體分組情況和喂養(yǎng)情況為:安靜對照組(CK)服用基礎(chǔ)飼料;補充磷脂對照組(PC)和鈍挫傷后自然愈合組(NH)服用添加大豆粉末磷脂的飼料;鈍挫傷后補充磷脂愈合組(PB).

1.2 重物擊打構(gòu)建腓腸肌鈍挫傷模型

結(jié)合前期我們對于骨骼肌鈍挫傷的研究[7],將實驗大鼠經(jīng)10 g/L硫噴妥鈉麻醉后,固體木制圓柱體下落導(dǎo)致右小腿內(nèi)側(cè)面(其皮下為腓腸肌中段)一次打擊傷[7],打擊面的直徑為110 cm.下落物體的長度為20 cm,質(zhì)量為620 g,從垂直40 cm高處落下,計算后重力為6108 N,動能為2143 J.骨骼肌鈍挫后,解剖證實鈍挫傷發(fā)生情況[8].

1.3 測定大鼠腓腸肌 SOD、CAT、GSH-Px及 MDA變化情況

鈍挫傷后12 h、24 h、2 d、10 d、17 d、30 d 后采用戊巴比妥鈉麻醉將腓腸肌整塊取出,在冰浴中用玻璃勻漿器勻漿組織,用漩渦混合儀震蕩30秒后冰浴放置5分鐘,使用200 ul的移液器將組織勻漿液轉(zhuǎn)移至EP管中;放入高速冷凍離心機(jī)14000 r/min、4℃離心30分鐘,將上清液轉(zhuǎn)移至新的EP管中,標(biāo)記好后放入-70℃冰箱內(nèi)備用.

SOD活性測定采用黃嘌呤氧化酶法,MDA含量測定采用硫代巴比妥酸法,CAT活性測定采用可見光法,GSH-Px活性測定采用谷胱甘肽氧化法,組織蛋白質(zhì)濃度檢測采用考馬斯亮蘭法,標(biāo)準(zhǔn)蛋白為BSA.上述試劑盒購自南京建成,具體操作參照試劑盒說明書進(jìn)行.吸光度利用美國BECKMAN公司生產(chǎn)的BU800紫外分光光度計測定.

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析

數(shù)據(jù)統(tǒng)計采用SPSS12.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行分析,實驗數(shù)據(jù)均以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示,組間比較采用單因素方差分析,兩組間比較采用t檢驗,P<0.05表示具有顯著性差異,P<0.01表示具有極顯著性差異.

2 實驗結(jié)果

2.1 不同組別大鼠腓腸肌SOD活性變化情況

大鼠腓腸肌鈍挫傷后,NH組SOD活性表現(xiàn)為先上升再回落的趨勢(圖1).鈍挫傷后12 h內(nèi),PB組SOD活性較CK和PC組顯著性上升(P<0.05),24 h后檢測發(fā)現(xiàn)顯著性消失,至2-10 d后,檢測發(fā)現(xiàn)PB組SOD活性與對照組出現(xiàn)極顯著性差異(P<0.01).而自然愈合組在損傷后12 h內(nèi),SOD活性與CK和PC組相比出現(xiàn)顯著性上升(P<0.05);隨著CK和PC組SOD活性的上升,至鈍挫傷后24 h,NH組與CK和PC組SOD活性之間未檢出顯著性差異;與此同時,鈍挫傷后2-10 d里,PB組大鼠腓腸肌SOD活性顯著高于NH組(P<0.01).鈍挫傷后第10 d,PB組大鼠腓腸肌SOD活性達(dá)到最高值并仍顯著性高于NH組、CK組及PC組.從第10d后,PB組SOD活性呈下降趨勢,但仍高于其他三組.由此可見,補充磷脂在鈍挫傷12 h內(nèi)能提高大鼠腓腸肌SOD活性,同時能預(yù)防鈍挫傷后2-10天自然愈合組出現(xiàn)的SOD活性急劇下降的過程,從而能長時間提高鈍挫傷后腓腸肌SOD活性,有利于腓腸肌鈍挫傷后修復(fù)過程.

2.2 不同組別大鼠腓腸肌MDA含量變化情況

大鼠受到鈍挫傷后,PB及NH組中MDA含量在損傷后的2 d內(nèi),都表現(xiàn)出相對于對照組顯著性上升的趨勢,但是上升的比例有所不同.在鈍挫傷后12 h內(nèi),雖然頓挫組MDA含量出現(xiàn)上升,但未出現(xiàn)統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05);24 h后,PB及NH組MDA含量較CK和PC組出現(xiàn)顯著性升高(P<0.05),但兩組之間未出現(xiàn)顯著性差異(P>0.05);至損傷2 d后,PB組MDA含量顯著性高于對照組(P<0.01),同時顯著性高于PB組(P<0.05)說明自然愈合組內(nèi)出現(xiàn)大量脂質(zhì)過氧化反應(yīng),這種反應(yīng)在PB組內(nèi)得到有效遏制;損傷至10 d后,NH組MDA含量顯著性高于其他組(P<0.05),其他組內(nèi)部未發(fā)現(xiàn)顯著性差異,說明補充磷脂能有效遏制鈍挫傷初期(2-10 d)所發(fā)生的脂質(zhì)過氧化反應(yīng),有利于腓腸肌鈍挫傷后恢復(fù).

圖1 不同組別大鼠鈍挫傷后腓腸肌SOD活性變化(n=6)

圖2 不同組別大鼠腓腸肌MDA含量變化(n=6)

2.3 不同組別大鼠腓腸肌CAT活性變化情況

大鼠鈍挫傷后CAT活性變化主要發(fā)生在鈍挫傷后24 h內(nèi).鈍挫傷后12 h內(nèi),腓腸肌中CAT活性明顯升高(P<0.01),這種趨勢在PB組和NH組表現(xiàn)一致,未發(fā)現(xiàn)顯著性差異;至損傷24 h,PB及NH組CAT活性繼續(xù)上升,與對照組比較表現(xiàn)出具有顯著性差異,但是二者之間仍未出現(xiàn)顯著性差異(P>0.05)說明,損傷早期(24 h之內(nèi)),CAT活性會顯著性提高,說明鈍挫傷會導(dǎo)致活性氧代謝增強而使H2O2積累增加,從而導(dǎo)致細(xì)胞膜受到損害,加速細(xì)胞凋亡過程;補充磷脂組的CDK活性與自然愈合組并未表現(xiàn)出顯著性差異,說明CDK活性的升高,可能是機(jī)體自適應(yīng)過程,補充磷脂對緩解活性氧的產(chǎn)生,消除H2O2積累作用不明顯.

圖3 不同組別大鼠腓腸肌CAT活性變化(n=6)

2.4 不同組別大鼠腓腸肌GSH-Px活性變化情況

大鼠腓腸肌鈍挫傷后24 h內(nèi),PB及NH組GSH-Px活性較對照組出現(xiàn)上升趨勢,但統(tǒng)計學(xué)上未達(dá)到顯著性水平(P>0.05),同時PB組及NH組之間未出現(xiàn)顯著性差異(P>0.05);至損傷2 d后,NH組GSH-Px含量顯著性高于CK和PC組(P<0.05),PB組GSH-Px活性也顯著性提高(P<0.01);至損傷后10d,NH組和PB組GSH-Px活性極顯著性高于對照組(P<0.01),同時PB組顯著性高于 NH組(P<0.05).損傷10 d后,PB組與NH組GSH-Px含量逐漸下降,至損傷后30 d,恢復(fù)至對照組GSHPx活性水平.說明,損傷后補充磷脂從2 d起能顯著性加快自由基清除,至10 d能最大程度提高GSH-Px活性,至24d后逐漸恢復(fù)至對照組GSH-Px水平.

圖4 不同組別大鼠腓腸肌GSH-Px活性變化(n=6)

3 討論

大鼠骨骼肌急性鈍挫傷后,氧化應(yīng)激反應(yīng)主要發(fā)生在損傷部位,對于機(jī)體整體氧化及抗氧化水平影響未出現(xiàn)顯著性變化[8],因此本研究主要采用對大鼠鈍挫傷后取腓腸肌作為主要研究部位.大鼠腓腸肌鈍挫傷后,超氧離子由于"呼吸爆發(fā)"過程而大量產(chǎn)生,從而對大鼠腓腸肌肌細(xì)胞膜等產(chǎn)生進(jìn)一步損傷[9].磷脂作為細(xì)胞膜雙分子層中重要的原料物質(zhì),能夠?qū)ι锬さ牧鲃有?、通透性和完整性起著重要作?對骨骼肌運動疲勞等過程中自由基清除、細(xì)胞凋亡等具有積極意義[6,8,11].但是尚未發(fā)現(xiàn)對急性骨骼肌損傷修復(fù)過程中補充磷脂對自由基代謝的影響的相關(guān)報道.本研究旨在通過對大鼠腓腸肌鈍挫傷后修復(fù)過程中補充磷脂對SOD、MDA、CAT及GSH-Px等酶系統(tǒng)影響的研究,探討補充磷脂對于大鼠腓腸肌鈍挫傷后修復(fù)過程對于氧自由基反應(yīng)和脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的影響.

SOD是人體中一種比較重要的氧自由基清除劑,能將體內(nèi)超氧自由基轉(zhuǎn)化為過氧化氫,參與人體抗氧化、抗疲勞、抗衰老等等重要生理過程[11],因此常被用作機(jī)體抗氧化能力的重要指標(biāo).本研究中,補充磷脂在鈍挫傷12 h內(nèi)能提高大鼠腓腸肌SOD活性,同時能預(yù)防鈍挫傷后2-10天自然愈合組出現(xiàn)的SOD活性急劇下降的過程,從而能長時間提高鈍挫傷后腓腸肌SOD活性,有利于腓腸肌鈍挫傷后修復(fù)過程.因此,補充磷脂能在鈍挫傷后恢復(fù)的早期(2-10 d)顯著提高SOD在機(jī)體內(nèi)的活性,延長機(jī)體抵抗氧自由基的能力,從而保護(hù)細(xì)胞膜免受氧自由基的破壞.

脂質(zhì)過氧化過程中發(fā)生的活性氧物質(zhì)(ROS)氧化生物膜的過程,即ROS與生物膜的磷脂、酶和膜受體相關(guān)的多不飽和脂肪酸的側(cè)鏈及核酸等大分子物質(zhì)起脂質(zhì)過氧化反應(yīng)形成脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物.MDA是ROS氧化的終產(chǎn)物,其含量可反映機(jī)體內(nèi)脂質(zhì)過氧化的程度及細(xì)胞損傷的程度[11].本研究中.PB及NH組中MDA含量在損傷后的2d內(nèi),都表現(xiàn)出相對于對照組顯著性上升的趨勢,但是上升的比例有所不同.至損傷2 d后,PB組MDA含量顯著性高于對照組(P<0.01),同時顯著性高于PB組(P<0.05)說明自然愈合組內(nèi)出現(xiàn)大量脂質(zhì)過氧化反應(yīng),這種反應(yīng)在PB組內(nèi)得到有效遏制.因此,補充磷脂能在鈍挫傷后2 d之內(nèi)有效控制ROS引起的生物膜、膜受體相關(guān)的多不飽和脂肪酸及核算等大分子物質(zhì)發(fā)生脂質(zhì)過氧化反應(yīng),從而降低鈍挫傷造成的損害.

CAT是一種酶類清除劑,是生物防御體系的關(guān)鍵酶之一,存在于紅細(xì)胞及某些組織內(nèi)的過氧化體中,它的主要作用就是催化H2O2分解為H2O與O2,使得H2O2不致于與O2在鐵螯合物作用下反應(yīng)生成非常有害的-OH.研究發(fā)現(xiàn),損傷后CAT活性上升主要集中在損傷后24 h之內(nèi),同時補充磷脂能促進(jìn)CAT活性上升,但是與自然愈合組相比,未發(fā)現(xiàn)顯著性差異.

GSH-Px可以清除由活性氧和-OH誘發(fā)的脂質(zhì)過氧化物,保護(hù)細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)和功能的完整性.大鼠腓腸肌鈍挫傷后24 h內(nèi),PB及NH組GSH-Px含量較對照組出現(xiàn)上升趨勢,說明損傷后24 h內(nèi),脂質(zhì)過氧化水平上升;但是PB組和NH組間未發(fā)現(xiàn)顯著性差異,說明,損傷后24 h內(nèi)補充磷脂未能顯著降低脂質(zhì)過氧化水平;至損傷2 d至10 d,PB組GSH-Px活性顯著性高于對照組(P<0.01);至損傷后10 d,同時PB組顯著性高于NH組(P<0.05).說明,補充磷脂能從大鼠腓腸肌鈍挫傷2d后顯著性提高GSH-Px活性,從而加快脂質(zhì)過氧化物清除,保護(hù)細(xì)胞膜完整性.

4 結(jié)論

與損傷后自然愈合組比較,補充磷脂能在大鼠腓腸肌鈍挫傷后恢復(fù)的2-10d,能顯著提高大鼠受損腓腸肌中SOD、GSH-Px活性,降低MDA含量,表明補充磷脂對于清除大鼠受損骨骼肌內(nèi)氧自由基反應(yīng)和脂質(zhì)過氧化反應(yīng),加快消除損傷后發(fā)生的氧自由基,降低脂質(zhì)過氧化水平,提高急性骨骼肌鈍挫傷恢復(fù)效果具有促進(jìn)作用.

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